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%

\begin{document}
\centerline{Notizen zum Abschnitt}

\vspace*{0.5cm}

\centerline{\Large\bf Struktur einzelstr\"angiger Nukleins\"auren}

\vspace*{0.5cm}

\centerline{der BC4-Vorlesung}

\vspace*{2cm}

\centerline{Walter Fontana}
\centerline{Institut f\"ur Theoretische Chemie}

\vspace*{0.5cm}

\centerline{Wien, Dezember 1996}

\vspace*{1.5cm}

\tableofcontents

\newpage

\section{Einleitung}

Viele RNAs liegen als Einzelstrang vor. Die Chargaff-Regeln
($\chi_A=\chi_U, \chi_G=\chi_C$) sind nicht erf\"ullt.  Hinweise
erh\"alt man auch aus der Abh\"ang\-igkeit hydrodynamischer und
optischer Eigenschaften (Viskosit\"atsuntersuchungen und
Birefringenzmessungen) von rRNA.  Die Viskosit\"at von rRNA L\"osungen
variiert stark mit der Salzkonzentration. Eine Steigerung der
Ionenst\"arke bewirkt bis zur 100-fachen Abnahme der
(Grenz-)Viskosit\"at. Die Viskosit\"at von DNA (sowie homopolymeren
Nukleins\"auren) wird dagegen kaum beeinflusst. Schluss: RNA ist ein
kontraktiler Einzelstrang-Coil. Francis Crick schl\"agt bei einem
Mittagessen in Wien vor, dass RNA unter bestimmten Bedingungen auf
sich selbst zur\"uckfalten kann und eine Sekund\"arstruktur einnimmt.
Es wird vermutet, dass RNA eine partielle Helix-Struktur hat
(40\%-60\%) und die Doppelhelix-Abschnitte von flexiblen
Einzelstrang-Abschnitten (``loops'') unterbrochen werden. Dies ist bis
heute die Grundlage unseres Verst\"andnisses der Sekund\"arstruktur
von RNA.

Die Sequenz der tRNA-Ala wird von Holley 1965 vorgestellt und wurde
die Grundlage f\"ur das Kleeblatt-Modell. In den sp\"aten 70er Jahren
f\"uhrten vergleichende Sequenzanalysen zu einem Vorschlag f\"ur die
Sekund\"arstruktur von rRNA. Unser gegenw\"artiges Verst\"andnis der
Terti\"arstruktur von RNA beruht auf den
r\"ontgen\-kristallo\-graphischen Untersuchungen von tRNA (Kim 1974,
Robertus 1974). Die Wechselwirkungen, die die 3D Struktur bedingen,
sind neuer Art: Basen-Tripel und Wechselwrikungen zwischen Basen und
Phosphodiester-``R\"uckgrat''.  Die Terti\"arstruktur von rRNA ist
noch nicht endg\"ultig gekl\"art.

Wie verhalten sich Nukleins\"auren in w\"assriger L\"osung? Welche
Arten geordneter Strukturen nehmen sie ein? Wie kann man diese
beobachten? Warum sind RNA und DNA strukturell so unterschiedlich,
obwohl sie sich in ihrer Zusammensetzung doch nur im 2'-Sauerstoffatom
unterscheiden? Was folgt daraus f\"ur unser Verst\"andnis der Rolle
dieser Polymere in der Organisation der Zellvorg\"ange?  Welche
Abstraktionen erweisen sich als n\"utzlich in der Beschreibung von RNA
Strukturen? Welche Methoden gibt es zur ihrer Berechnung?

Im Gegensatz zu Proteinen haben Nukleins\"auren eine wesentlich
geringere Vielfalt funktionaler Gruppen und chemische assays zur
Strukturuntersuchung sind daher kaum m\"oglich. Man k\"onnte annehmen,
dass diese chemische Einfalt sich letztlich auch in einer
strukturellen Einfalt widerspiegelt.  Das ist aber ganz und gar nicht
der Fall. Einzelstr\"angige Nukleins\"auren weisen ein phantastisches
Spektrum struktureller Vielfalt auf. Ein Verst\"andnis dieser Vielfalt
ist allerdings leichter als bei Proteinen. Nukleins\"auren bestehen im
Wesentlichen aus nur vier Bausteinen. Es stehen daher entsprechend
weniger fundamentale Wechselwirkungen zum Strukturaufbau zur
Verf\"ugung. Die meisten Wechselwirkungen, die die Struktur langer
Nukleins\"auren bedingen, treten bereits bei den kleinsten Fragmenten
auf: den Dinukleotiden oder wenig l\"angeren Ketten. Wirkungsvolle
experimentelle Techniken k\"onnen deshalb auf kleine Fragmente
angewandt werden.  Von diesen ist der Schluss zu Eigenschaften
l\"angerer Ketten gestattet. Dies gelingt selbst dann, wenn die
Struktur nicht nur von der Basenzusammensetzung, sondern von der
Sequenz -- der Reihenfolge der Basen in der linearen Kette --
abh\"angt.  Im Gegensatz dazu sind Dipeptide schlechte Modelle f\"ur
die Struktur ganzer Proteinen.

Antworten auf Fragen nach der Wirkungsweise von Proteinen verlangen
meistens eine Kenntnis der detaillierten 3D Konformation.  Das ist ein
schwieriges Unterfangen. Dagegen scheint es als k\"onne man wichtige
Teilaspekte der Funktion von Nukleins\"auren bereits auf einem viel
abstrakterem Niveau - dem Niveau der Sekund\"arstruktur - verstehen.
Die Sekund\"arstruktur von Nukleins\"auren entsteht dadurch, dass ein
Einzelstrang durch Ausbildung von intramolekularen Basenpaaren (etwa
der Watson-Crick Art) auf sich selbst zur\"uckfalten kann. Unter der
Sekund\"arstruktur einer RNA-Sequenz versteht man im Wesentlichen eine
Liste der gepaarten Basen. Der Unterschied zu Proteinen besteht darin,
dass die Basenpaar-Wechselwirkung bin\"ar ist -- sie beschr\"ankt sich
\"uberwiegend auf 2 Basen -- und ``digital'' -- entweder zwei Basen
paaren oder sie tun's nicht.  Eine solcher Strukturbegriff weist einen
diskreten kombinatorischen Charakter auf, dessen Logik uns im letzten
Teil dieses Abschnitts besch\"aftigen wird.

\section{Struktur-Unterschiede RNA/DNA}

Die \"uberwiegende Mehrzahl von RNAs liegt als kovalenter Einzelstrang
vor.  RNA/DNA Hybrid-Doppelstr\"ange treten als Zwischenprodukte bei
der Transkription auf; entweder bei der normalen Transkription, in der
ein RNA Strang von einer DNA Vorlage kopiert wird, oder bei der
reversen Transkription, bei der anhand einer RNA-Matrize ein DNA
Strang entsteht.  Die reverse Transkriptase ben\"otigt zudem einen RNA
primer um die DNA Synthese zu starten und daher tritt auch eine
vor\"ubergehende Situationen auf, in der ein RNA Abschnitt kovalent an
einen DNA Abschnitt gebunden ist.

Warum findet man keine nat\"urlich vorkommenden Nukleins\"aure-Ketten,
in denen Ribonukleotide und Deoxyribonukleotide gemischt auftreten?
Der Grund daf\"ur ist, dass Ribo- und Deoxyribo-Ketten {\em in vivo\/}
Helixkonformationen mit recht unterschiedlicher Geometrie bevorzugen.

Erinnern wir uns zun\"achst an die helikalen Geometrien der DNA.  Die
A- und B-Formen (eigentlich sind es ``Familien'', da es eine Reihe von
Varianten dieser Grundformen gibt) bestehen aus antiparallel laufenden
Str\"angen, die rechtsh\"andig gewunden sind. In der beigelegten
Tabelle sind einige der charakteristischen Helix-Parameter
gegen\"ubergestellt. Der wesentliche geometrische Unterschied zwischen
A und B Form ist (a) die Neigung der Paare relativ zur L\"angsachse
der Helix (tilt) -- in der A-Form sind sie stark geneigt, kaum jedoch
in der B-Form -- und der Abstand der Basenpaare von der
Helix-L\"angsachse -- er ist gr\"osser bei der A-Form. DNA A- und B-Form
k\"onnen rasch durch Ver\"anderung der Feuchtigkeit in den Fibern
ineinander umgewandelt werden.

RNA-DNA Hybridhelices nehmen die A-Form an, selbst in w\"assriger
L\"osung. RNA Doppelhelices liegen ebenfalls und sogar ausschliesslich
als Helices der A-Familie vor.  Bei schwacher Ionenst\"arke hat die
RNA A-Helix 11 Basen pro Umdrehung, ein tilt der Basenpaare zur
Helixachse von $16-19^{\circ}$ und eine Gangh\"ohe von 30 \AA.  De
A'-Variante bei gr\"osserer Ionenst\"arke hat 12 Basen pro
vollst\"andiger Drehung, ein tilt von 10$^\circ$ und eine Gangh\"ohe
von 36 \AA. Die Torsionswinkel entsprechen sonst der A-Familie wie wir
sie von der DNA her kennen. Nie wurde bei RNA die B-Form
beobachtet. Die Ursache daf\"ur kann nur die Gegenwart der
$2'$-Hydroxylgruppe sein. Diese hat einen Einfluss auf den pucker der
Ribose. Das wird im Folgenden diskutiert.

Die Minimierung sterischer Konflikte zwischen den Ringsubstituenten
f\"uhrt dazu, dass der Ribose-pucker in Nukleotiden auf zwei Bereiche
eingeschr\"ankt ist: entweder der pucker ist am C$_{3'}$ lokalisiert
und zwar {\em endo\/} (\"uber dem Furanose-Ring liegend zum C$_{5'}$
hin orientiert) -- die Pseudorotationsphase nimmt Werte zwischen
0$^\circ$ und 36$^\circ$ an -- oder er sitzt am C$_{2'}$, ebenfalls
{\em endo\/} -- die Pseudorotationsphase ist zwischen 144$^\circ$ und
190$^\circ$.  Substituenten, die in der einen Phase axial liegen,
liegen in der anderen \"aquatorial.  Zwei \"Uberg\"ange vom
S\"ud-pucker (C$_{2'}$ {\em endo\/}) zum Nord-pucker (C$_{3'}$ {\em
endo\/}) sind logisch m\"oglich: via O$_4$ {\em exo\/} oder via O$_4$
{\em endo\/}. Energetisch ist nur der {\em endo\/} Weg
realisierbar.  (Die Base und der C$_5$-Substituent sind entlang der
{\em endo\/} Route \"aquatorial und behindern sich daher weniger.)
Monomere Ribonukleotide interkonvertieren rasch zwischen beiden
Formen, C$_{3'}$ {\em endo\/} und C$_{2'}$ {\em endo\/}, w\"ahrend
monomere Deoxyribonukleotide den C$_{2'}$ {\em endo\/} pucker etwas
bevorzugen. Elektronegative $2'$ Substituenten (Dipolmoment!)
verschieben das Gleichgewicht in Richtung C$_{3'}$ {\em endo}.

In einer Helix sind die Konformationen der einzelnen Nukleotide
nat\"urlich nicht mehr voneinander unabh\"angig, sondern werden von
den stacking Wechselwirkungen zwischen den Basen organisiert.  In der
Geometrie der A-Form ist der Ribose pucker ein C$_{3'}$ {\em endo\/},
w\"ahrend er in der B-Helix als C$_{2'}$ {\em endo\/} vorliegt
(IUPAC-b\"urokratisch gesehen ist es die C$_{3'}$ {\em exo\/}
Variante, die der C$_{2'}$ {\em endo\/} sehr \"ahnlich ist :-).  RNA
Dopelhelices liegen ausschliesslich in der A-Form vor.  Im Unterschied
zu den Mononukleotiden, ist der Ribose pucker im Kontext einer Helix
also auf eine Konformation festgelegt. Hingegen kann im Fall der
DNA-Doppelhelix der Deoxyribose pucker in beiden Konformationen
vorliegen, was zur A- und B-Form f\"uhrt. Die beiden Formen
konvertieren je nach Wasseraktivit\"at ohne dass Basenpaarungen
aufgehen m\"ussten. Der Grund warum RNA in der Helix-Struktur so
konservativ ist, ist eigentlich noch immer nicht klar.  Ein Trend zur
Bevorzugung der C$_{3'}$ {\em endo} Konformation (A-Form) ist mit der
Elektronegativit\"at der $2'$ OH Gruppe im Einklang (s.o.), kaum aber
eine Ausschliesslichkeit. Man vermutet dass die $2'$ OH Gruppe als
H-Donor an Wasserstoffbr\"ucken mit dem benachbarten Nukleotid
beteiligt ist.  Eine M\"oglichkeit w\"are eine H-Br\"ucke zum
n\"achsten O$_{4'}$, oder eine H$_2$O vermittelte Wechselwirkung mit
dem $3'$ Phosphat, oder aber auch einfache sterische Hinderung durch
die Hydroxy-Gruppe. Die Gr\"unde f\"ur die ausschliessliche A-Form in
RNA Helices sind wahrscheinlich vielf\"altig und systemischer Natur,
obwohl sie alle letztlich mit der Anwesenheit der $2'$-Hydroxygruppe
zusammenh\"angen m\"ussen.

Jetzt versteht man jedenfalls warum nicht Ribo- und
Dexoxyribonukleotide in ein und demselben Polymer beliebig gemischt
auftreten. Polyribonukleotid-Helices liegen in der A-Form vor,
w\"ahrend unter physiologischen Bedingungen Polydeoxyribonukleotide
die B-Form bevorzugen; wegen des stark unterschiedlichen Basen-Tilts
in den A- und B-Helix Formen k\"onnte die Kontinuit\"at des
Basen-``stackings'' nicht aufrechterhalten werden.  Somit entfiele die
wesentliche Stabilisierung der gesamten Helixstruktur.  Eine
Koexistenz von l\"angeren Abschnitten in A- und B-Form w\"are denkbar:
damit Basen-stacking erhalten bleibt w\"urde allerdings die
Schnittstelle zwischen A- und B-Form einen Knick (kink) in der Helix
verursachen.  Ein Beispiel k\"onnte der kovalente Hybridstrang sein,
der als Zwischenzustand bei der RNA geprimten DNA Synthese auftritt.

Zusammenfassend nocheinmal der Steckbrief der standard helikalen Anordnungen:
\begin{enumerate}

\item
Base ist {\em anti\/} relativ zum Zucker, d.h. Glycosyl (C$_{1'}$-N)
Torsionswinkel $\xi$ ist zwischen -90 und -160 Grad.

\item Zucker pucker ist C$_{2'}$ {\em endo\/} (Deoxyribose) oder
C$_{3'}$ {\em endo\/} (Ribose).

\item C$_{4'}$-C$_{5'}$ Torsion $\gamma$ im {\em +sc\/} Bereich
($\approx$ 60 Grad).

\item C-O Torsionswinkel $\beta$ und $\epsilon$ sind {\em trans\/}
($\approx$ 180 Grad).

\item in rechtsdrehenden Helices sind beide P-O Torsionswinkel
$\alpha$ und $\xi$ im {\em -sc\/} Bereich ($\approx$ 300 Grad).

\end{enumerate}

\section{Struktur und Stabilit\"at von Nukleins\"aure-Einzelstr\"angen}

Wir kennen nun die Doppelhelices von DNA und RNA, die durch
Watson-Crick Basenpaarung entstehen. Wie sieht aber die Konformation
einer Nukleotidkette aus, wenn sie als Einzelstrang vorliegt? Die
Situation liegt beispielsweise bei der Transkription von DNA in RNA
vor. Wenn eine solche Einzelkette Abschnitte enth\"alt, die zueinander
komplement\"ar sind, dann kann sie intramolekulare Watson-Crick-Paare
bilden. Mit diesem Fall werden wir uns ausf\"uhrlich sp\"ater
besch\"aftigen.  Zun\"achst betrachten wir Ketten, die keine
komplement\"aren Abschnitte enthalten, n\"amlich (synthetische)
Homopolymere wie etwa poly-dA oder poly-A.

Sind solche Polymere in irgendeiner Weise geordnet? Es gibt eine Reihe
m\"oglicher Ordnungsstrukturen: die Basen k\"onnen stacken und die
Kette in einer Einzel-Helix-Konformation halten -- wie eine
Doppel-Helix aus der ein Strang entfernt worden w\"are. Das andere
Extrem entst\"unde, wenn die stacking Wechselwirkung ohne Gegenstrang
nicht gehalten werden kann und der Einzelstrang ein Zufalls-Kn\"auel
wird. Eine weitere M\"oglichkeit sind Mehrfach-Helix-Konformationen,
weil auch identische Nukleotide zueinander Wasserstoffbr\"ucken
ausbilden k\"onnen. Diese sind nicht von der Watson-Crick Art, und die
Helices k\"onnten daher anders ausehen als im Fall der DNA.
Es werden aber auch Konformationen zwischen vollst\"andig
geordneter Struktur und ungeordnetem Kn\"auel zu erwarten sein.

Das Ausmass an Ordnung h\"angt stark von Temperatur, pH, Ionenst\"arke
und L\"osungsmittel ab. Die wichtigsten Methoden, die Auskunft \"uber
die Struktur einzelstr\"angiger Polynukleotide in L\"osung geben, sind
die bei Polymeren \"ublichen: optische Methoden (wie NMR, CD) und
hydrodynamische Methoden (wie Viskosit\"atsmessungen).  Wenn
homopolymere Nukleins\"auren Zufallskn\"auel w\"aren, d\"urften sich
die optischen Eigenschaften des Polymers nicht wesentlich von denen
des Monomers unterscheiden. Bei hohen Temperaturen (100 C) ist dies
f\"ur poly-A und poly-C auch der Fall. Bei tieferen Temperaturen kommt
es zu starken Abweichungen, die allesamt auf die Anwesenheit zumindest
abschnittsweiser Regelm\"assigkeiten in der Konformation schliessen
lassen. So zeigen poly-A und poly-C bei neutralem pH und bei
Raumtemperatur wesentlich st\"arkere CD Signale als die Monomeren.
Die CD-Signale sind zwar in ihrer Intensit\"at stark
temperturabh\"angig, nicht aber in ihrer Form. Das bedeutet, dass
welche geordneten Regionen auch immer existieren m\"ogen, diese sich
nicht in ihrer Art sondern nur in ihrer H\"aufigkeit ver\"andern. Die
wichtigste Bande im Absorptionsspektrum liegt bei ungef\"ahr 260
nm. Gestackte Basenanordnungen zeigen dabei geringere Absorption als
ungestackte -- das ist als hypochromer Effekt bekannt. Dieser wird
auch bei poly-A und poly-C beobachtet. Man kann also annehmen, dass
die Ordnungsbereiche aus stacks von Basen bestehen und dass ihre
Ausdehnung mit sinkender Temperatur zunimmt.

Man muss bedenken, dass solche Schl\"usse nur anhand von wesentlich
mehr Daten unterschiedlichster Art gezogen werden d\"urfen. So kann
man allein anhand von CD und hypochromen Effekt nicht weitere
Ordnungsmuster wie Basenpaarungen und Interkalation ausschliessen.
Die weitgehende Unabh\"angigkeit der spektroskopischen Eigenschaften
von der Ionenst\"arke erlauben im Fall von poly-C eine Interkalation
(oder allgemein Strukturen in denen Ladungen sich nahe kommen
w\"urden, wie etwa Mehrfachhelices) auszuschliessen. IR-Daten
schliessen hingegen eine Basenpaarung aus.

Viskosimetrische Messungen des Gyrationsradius von poly-C ergeben nur
bei fast durchgehendem stacking (i.e., bei tiefen Temperaturen) eine
drastische Zunahme des Gyrationsradius. Wir haben es also mit einer
Kette zu tun, die bei tiefen Temperaturen eine Einfachhelix ist und
mit Temperatur-Zunahme ``schmilzt'', d.h. die gestackten helikalen
Abschnitte werden k\"urzer und sind entsprechend h\"ufiger von lokal
ungeordneten Konformationen unterbrochen. Aus dem ersten Abschnitt
wissen wir, dass die dihedralen Winkel im
Ribosephosphodiester-R\"uckgrat starken sterischen Einschr\"ankungen
unterliegen. Dies verleiht der Kette eine gewisse Steifheit, sodass
sie selbst als ``Zufallskn\"auel'' noch einen hohen Gyrationsradius
aufweist. Erst wenn die gestackten Abschnitte fast durchgehend sind,
nimmt der Gyrationsradius rasch zu. Dieser Sachverhalt ergibt sich
auch aus der statistischen Mechanik von Polymerkonformationen nach
Flory.

Wie sieht die poly-C Helix aus? Sie geh\"ort zur bekannten A-Familie
von Helices, zu der auch die RNA Doppelhelix geh\"ort.  Poly-C hat
aber nur 6 Monomere pro Drehung. Die Torsionswinkel im
Helix-R\"uckgrat sind dabei den Torsionswinkeln der Mononukleotide
viel \"ahnlicher als sie es in der RNA Doppelhelix sind.  Soweit die
kristallographische Struktur bei neutralem pH. Bei kleineren pH Werten
wird das C am N-3 protoniert. Dabei wird ein C-C Basenpaar m\"oglich,
dass wahrscheinlich zwei poly-C Str\"ange in eine parallele
Doppelhelix \"uberf\"uhrt. Ganz schl\"ussig sind die Daten aber nicht.

\"Ahnlich verh\"alt es sich mit poly-A. Bei neutralem pH liegt eine
Einfachhelix vor. Im sauren Bereich bildet sich dagegen eine
Doppelhelix mit protoniertem A-A Paar.  Die Einzel-Helix geh\"ort
wiederum zur A-Familie und hat neun Basen pro Drehung. Die
Torsionswinkel sind wie im poly-C Fall dem Monomer sehr \"ahnlich.
Der Zucker pucker ist C$_{3'}$ {\em endo\/} wie sich das f\"ur die
A-Familie geh\"ort. Das deoxy-Analogon poly-dA hat hingegen den pucker
C$_{2'}$ {\em endo}, wie in der DNA Doppelhelixkonformation.

Zur Illustration der vielf\"altgien Ordnungsmuster bei homopolymeren
Nukleins\"auren diene noch poly-dT und poly-U. Poly-dT weist eine
rechts-drehende helikale Konformation auf in der die Basen nach
``aussen'' gedreht sind und nicht stacken.  Die Stabilit\"at ist
entsprechend reduziert. Poly-U ist interessant weil es als Homopolymer
bei niedriger Temperatur eine Sekund\"arstruktur ausbildet. Poly-U
faltet auf sich selbst zur\"uck und bildet eine doppelstr\"angige
antiparallele Haarnadel mit asymmetrischen U-U Paar. Poly-dU (!)
bildet keine Sekund\"arstruktur aus. Die Ursache daf\"ur kann wiederum
nur die $2'$ Hydroxygruppe sein. Wie sie aber genau wirkt ist
unklar. Poly-G bildet schliesslich gar eine rechtsh\"andige 4-fach
Helix; ein Verhalten das bereits beim Monomer Guanosin sich
ank\"undigt: Guanosin und etliche seiner Derivate aggregieren aus
w\"assriger L\"osung zu einem Gel mit tetrameren wasserstoffvernetzten
Anordnungen.

\section{Die Terti\"arstruktur von RNA am Beispiel der tRNA} 

Das Interesse an einzelstr\"angigen Nukleins\"auren ersch\"opft sich
nicht in der faszinierenden und schwierigen statistischen Mechanik
rotationsm\"assig einge\-schr\"ankter langer Ketten. Das eigentliche
Interesse gilt der starken Sequenzabh\"angig\-keit ihrer Struktur.
Wie bereits erw\"ahnt, k\"onnen einzelstr\"angige Nukleins\"auren
intramolekulare Watson-Crick Paare ausbilden. Die Kette faltet dadurch
auf sich selbst zur\"uck und bildet helikale Abschnitte. Das f\"uhrt
notwendigerweise auch zu Schleifen (loops) verschiedenster Art und
er\"offnet den Nukleins\"auren eine enorme Vielfalt struktureller
Formen.  Dies wiederum erm\"oglicht spezifische Wechselwirkungen mit
anderen Molek\"ulklassen.  Im letzten Jahrzehnt wurde deutlich dass
Nukleins\"auren auch katalytisch aktiv sein k\"onnen. Wir werden auf
die Struktur-Funktions Beziehungen in RNA noch zzur\"uckkommen.  RNAs
haben mit Proteinen ein reiches Repertoire an Strukturen und die
M\"oglichkeit zu ihrer Variation (durch Variation der Sequenz)
gemeinsam.  Was aber RNA von Proteinen ganz entscheidend abhebt, ist
die Kopierbarkeit der Sequenz: die Spezifizit\"at der Basenpaarung,
die f\"ur Struktur verantwortlich ist, erm\"oglicht gleichzeitig ihre
Matrizenfunktion. RNA ist derzeit die einzige bekannten Objektklasse,
die Genotyp und Ph\"anotyp in einem einzigen Molek\"ul vereinigt. 

Wir wenden uns nun der tRNA und ihrer Terti\"arstruktur zu. Die tRNA
dient hier als {\em pars pro toto\/} um einige Prinzipien der
sequenzabh\"angigen 3D-Struktur einzelstr\"angiger Nukleins\"auren zu
illustrieren. F\"ur Biophysiker war die tRNA die erste
hochaufl\"osende R\"ontgenstrukturanalyse einer RNA (Kim, 1974 und
Robertus, 1974) und eines RNA/Protein Komplexes (Rould, 1989). tRNA
forderte die Biochemiker zur ersten Sequenzbestimmung einer RNA heraus
(Holley, 1965). F\"ur Chemiker war tRNA die erste Synthese eines
biologisch aktiven Gens (Ryan, 1979). tRNA spielte nat\"urlich eine
entscheidende Rolle bei der Aufkl\"arung des genetischen Codes. F\"ur
Molekularbiologen wurde die Wechselwirkung zwischen tRNA und den
Aminoacyltransferasen zum meist studierten Fall spezifischer
RNA/Protein Wechselwirkungen. Molekular-Archaeologen nutzten tRNA zur
Aufkl\"arung evolution\"arer Beziehungen zwischen Organismen und zur
Datierung des genetischen Codes.

tRNA Molek\"ule gibt es in jeder Zelle. Die tRNA Population schwankt
von 29 Spezies in {\em Mycoplasma\/} - dem kleinsten autonomen
selbst-reproduzierendem Organismus - bis zu mehr als 150 Spezies in
einer S\"augerzelle. Die Hauptfunktion dieser RNA Klasse ist die
Aktivierung von Aminos\"auren zur Proteinbiosynthese. F\"ur diese
Funktion gibt es \"ublicherweise mehrere tRNA Spezies f\"ur jede
Aminos\"aure (Isoakzeptoren).  Zwei kritische Regionen der tRNA sind
das Anticodon, das mit einem messenger RNA Codon wechselwirkt, und das
Akzeptorende mit dem universellen CCA Abschnitt, dessen Adenosin an
der $2'$ oder $3'$ Position mit der dieser tRNA spezifisch
zugeordneten Aminos\"aure verestert wird. Unterschiedliche
Zellkompartimente - Cytoplasma, Chloroplasten, Mitochondrien -
enthalten ihre eigenen unterschiedlichen Proteinsynthese-Maschinerien;
Chloroplasten und S\"augermitochondrien haben eigene tRNAs, die sich
von den zytoplasmatischen unterscheiden.

Man kennt derzeit etwa 2000 tRNA oder tRNA-Gen Sequenzen aus mehr als
200 Organismen und Organellen. Ihre L\"ange variiert zwischen 72 und
95 Nukleotiden; die meisten dieser Sequenzen lassen sich in die
bekannte Kleeblatt-Sekund\"arstruktur falten. Eine bemerkenswerte
Ausnahme sind die tRNAs von S\"auger-Mitochondrien, von Flagellaten
und Nematoden. Diese zeigen starke Abweichungen von der Standard
Kleeblatt-Struktur. Eine weitere Eigenheit der tRNAs ist ihr hoher
Gehalt an modifizierten Nukleosiden. Das Ausmass modifizierter Basen
erreicht bis zu 25\% in Human-tRNA und ist wesentlich geringer in
bakterieller tRNA. Gegenw\"artig sind die Strukturen 80 modifizierter
Basen bekannt.

Die Biosynthese von tRNA geschieht durch Transkription von DNA. Es
entsteht dabei eine l\"angere precursor-tRNA. Ein einziges Transkript
kann auch mehrere (21 in {\em B.~subtilis\/}) Kopien verschiedener
tRNAs enthalten. In Eukaryonten ist das Transkript monomer.  Mehrere
Exo- und Endonukleasen sind n\"otig um die \"ubersch\"ussigen
Nukleotide zu entfernen. Einige der Basen werden direkt am Transkript
methyliert, w\"ahrend andere in ihrer Originalversion ausgeschnitten
und durch andersweitig synthetisierte und modifizierte Basen ersetzt
werden.

In einigen F\"allen enth\"alt das tRNA Transkript Introns. Es ist
bemerkenswert, dass tRNA Gene zwei unterschiedliche Arten von Introns
aufweisen, die auch auf unterschiedliche Weise entfernt werden.  In
Eukaryonten werden die Introns (L\"ange 8-60) auf die \"ubliche
enzymatische Art ausgeschnitten, w\"ahrend einige
Chloroplasten-Transkripte sich selbst ``spleissen'': ihr Intron (458
Nukleotide !) weist Sequenz\"ahnlichkeiten mit den group I Introns
auf. Evolution\"ar weit auseinanderliegende Bakterien weisen ebenfalls
200 Nukleotide ``kurze'' group I Introns in ihren tRNA Transkripten
auf.  tRNA wird auch editiert: an einigen Positionen werden die
transkribierten Standardbasen in andere Standardbasen umgewandelt.

Nach diesem biochemischen Steckbrief der tRNA kehren wir zu ihrer
Struktur zur\"uck. Zun\"achst eine Kl\"arung zum Begriff der
Sekund\"artsruktur.  Ein Basenpaar teilt eine offene Region in zwei
offene Regionen unterschiedlicher Gr\"osse. Der entartete Fall, in dem
eine Region die Gr\"osse 0 hat, ist nichts anderes al ein Stack zweier
aufeinanderfolgender Paare. Unter der Sekund\"arstruktur einer
Nukleins\"aure-Sequenz versteht man nun eine Liste von Basenpaaren mit
der einzigen Einschr\"ankung, dass sie keine Paare zwischen offenen
Regionen enth\"alt. Letztere nennt man Pseudoknoten und diese werden
-- wie alle anderen Konformationsaspekte -- zu den Terti\"arkontakten
gez\"ahlt. Wir werden auf den formalen Begriff der Skund\"arstruktur
sp\"ater noch genauer eingehen. Er sei hier nur erw\"ahnt, weil er
n\"utzlich in der Diskussion der Terti\"arstruktur ist.

Die Kleeblatt-Sekund\"arstruktur besteht aus vier gepaarten Regionen.
Diese werden Akzeptor-, Anticodon-, D- und T-Region oder -Arm (oder
loop) genannt.  In der Akzeptor-Region kommen die beiden $3'$ und $5'$
Enden zusammen.  Das $3'$ Ende enth\"alt die CCA Sequenz deren A mit
der entsprechenden Aminos\"aure verestert wird. Die D- und T-Regionen
heissen so, weil ihre zugeh\"origen loops immer ein Dihydrouridin (D)
und ein Ribothymidin (T) enthalten. Die L\"angen der gepaarten
Regionen und ihrer Schleifen ist im allgemeinen konstant. Die
\"ubersch\"ussigen Nukleotide l\"angerer tRNAs bilden den sogenannten
variablen oder V-loop, der zwischen 4 und 21 Nukleotide enthalten
kann. Wenn man tRNAs vergleicht, dann stellt man fest, dass
verh\"altnism\"assig wenige Nukleotide invariant sind. Das wollen wir
gleich festhalten, denn es sagt bereits etwas wichtiges \"uber die
Sequenz-Struktur Zuordnung aus: Sie ist nicht bijektiv. Es gibt viele
verschiedene Sequenzen, die in die gleiche ``Struktur'' falten -
zumindest auf der Ebene der Sekund\"arstruktur. Das Thema werden wir
sp\"ater wieder aufnehmen. Die invarianten Nukleotide sind in der
beigelegten Abbildung eingekreist und befinden sich vornehmlich in den
loops der Sekund\"arstruktur. Man sieht auch dass einige dieser
Invarianten an Pseudoknoten-Paarungen - also Terti\"arkontakten -
beteiligt sind.

Die R\"ontgenstrukturanalyse ergibt eine L-f\"ormige
Terti\"arstruktur.  Sie besteht aus zwei zueinander fast senkrecht
liegenden Doppel-Helices.  Eine schematische Darstellung dieser L-Form
und ihres Zusammenhangs mit der Sekund\"ar\-struktur findet man
ebenfalls in der Abbildung. Die Helices geh\"oren erwartungsgem\"ass
zur A-Familie. Die beiden Enden des ``L'' bestehen aus dem CCA
Akzeptor-Ende und dem Anticodon. Akzeptor- und T-Arm sind an ihren
inneren Enden gestackt und bilden somit eine durchgehende 11
Nukleotide lange Doppelhelix. Anticodon- und D-Arm sind \"ahnlich
angeordnet, stacken aber nicht.  Zwischen beiden helikalen Abschnitten
ist ein Knick von 26 Grad. Die Terti\"artsruktur wird zus\"atzlich zu
den Pseudoknoten von einer Reihe nicht-standard Basenpaaren und
Basentripel in Form gehalten. Sie treten geh\"auft in der Knickregion
des ``L''s auf.

Ein nicht-Watson-Crick Paar ist das G-U Paar.  G-U Paare trifft man
recht h\"aufig im Inneren von RNA Helices an, und sie z\"ahlen bei der
Ermittlung der Sekund\"arstruktur zum Standard-Paarungsrepertoire. Sie
passen relativ gut in die Watson-Crick Geometrie der RNA Helix und
erzeugen nur eine geringf\"ugige Ausbuchtung des
Phosphatr\"uckgrates. Das G$_{15}$-C$_{48}$ Paar ist ein ``reverse
Watson-Crick-Paar'' und die gegen\"uberliegenden Kettenabschnitte
verlaufen parallel. Ferner gibt es ein ``reverse Hogsteen-Paar'' (mit
antiparalleler Ausrichtung) zwischen dem methylierten m$^1$A$_{58}$
und dem T$_{54}$. Die Watson-Crick Anlagestelle ist beim m$^1$A$_{58}$
durch Methylierung blockiert und Hogsteen-Paarung ist die einzige
Alternative. Das G$_{26}$ ist zweifach methyliert und paart
ausgesprochen nicht-Watson-Crickisch mit A$_{44}$. Starke sterische
Hinderung zwingt das Paar in eine nicht-planare Anordnung. Das Paar
befindet sich genau an der Schnittstelle zwischen Anticodon-Arm und
D-Arm. In der nicht-planaren Anordnung stackt das GA Paar mit beiden
Helices und stabilisiert somit den 26-Grad Knick zwischen diesen
Armen.

Es existieren auch eine Reihe von Basen-Tripel, die aus einem
Watson-Crick Paar bestehen, das \"uber eine oder zwei
Wasserstoffbr\"ucken mit einer weiteren Base verkn\"upft ist. Details
findet man in der beigelegten Abbildung. Das A-A Basenpaar im A-U-A
Tripel hat die gleiche Geometrie, wie man sie aus der protonierten
poly-A Doppelhelix kennt, der wir im letzten Kapitel begegnet sind.
In all diesen Tripel sind die Kettenverl\"aufe notwendigerweise einmal
parallel und einmal antiparallel.

In Hefe tRNA$^{Phe}$ sind 42 von 76 Basen an helikalen Strukturen des
standard A-Typs beteiligt. Trotzdem nehmen 71 Basen an stacking
Wechselwirkungen teil. Die nicht-gestackten sind unter anderem das
terminale A und die beiden Dihydrouracile an Position 16 und 17.  Die
beiden letzteren sind nicht planar und nicht aromatisch und m\"ogen
stacking daher gar nicht.

Eine weitere wichtige Spielart der stacking-Wechselwirkung ist in tRNA
zu beobachten: Interkalation, d.h. das Einf\"ugen einer Base zwischen
zwei Aufeinanderfolgenden an einem benachbarten Strang. Insgesamt gibt
es vier Interkalationen in der Hefe tRNA$^{Phe}$. F\"ur diese
Wechselwirkung muss der Abstand der benachbarten Basen, zwischen die
interkaliert wird, etwas gestreckt werden. Dies geschieht \"uber das
Riboser\"uckgrat indem der pucker Zustand an der Ribose eines
Nukleotids vom standard C$_{3'}$ {\em endo\/} zum C$_{2'}$ {\em
endo\/} wechselt. Solche pucker-Zustands\"anderungen erfolgen auch bei
den \"Uberg\"angen von helikalen Segmenten zu ungepaarten
loop-Regionen.

Eine charakteristische Abweichung von der helikalen Konformation
entsteht ferner wenn die $\alpha$ (P-O$_{5'}$) und $\eta$ (O$_{3'}$-P)
Torsionswinkel in {\em ap\/} (anti periplanar, d.h. 150-180 Grad,
d.h. auf gut deutsch: trans) respektive {\em -sc\/} (minus syn-clinal,
d.h., 270-330 Grad, oder -gauche; normal f\"ur $\eta$) Bereiche
gelangen (siehe Abbildung).  Geometrisch bewirkt diese Konfiguration
eine scharfe ``Kurve'' - ein sogenannter $\pi$-turn.  Die beiden
Ribosen, die durch einen derartig konfigurierten Phopshatdiester
verbunden sind, zeigen dabei in antiparallele Richtung. (Stabilisiert
werden diese Konformationen noch zus\"atzlich durch das stacken eines
dem turn folgenden Phosphats mit einer Base.) Es gibt drei geometrisch
unterschiedliche turns mit weiterer Abstufung in ihrer Sch\"arfe. Wir
wollen hier nicht weiter in ihre Klassifikation eindringen... Wichtig
ist aber dass ein solcher $\pi$-turn im Anticodon loop auftritt und
zwar am $3'$ Phosphat eines invarianten Nukleotids.  Dies scheint eine
strukturelle Invariante vieler tRNAs zu sein.

Von besonderem Interesse ist das Anticodon-Triplett. Die drei
Anticodon Nukleotide sind in einer Konformation die einer
einzelstr\"angigen RNA Helix entspricht. Man vermutet, dass auf diese
Weise bei der Paarung mit dem entsprechenden Codon-Triplett einer mRNA
eine Doppelhelix Konformation entsteht. 

tRNA hat offensichtlich eine faszinierende und komplizierte Struktur.
Sie h\"alt sich allerdings nicht ganz von ``alleine'' aufrecht. Wie
alle Nukleins\"auren ist tRNA ein Polyanion. Die Gegenwart bestimmter
Kationen ist erforderlich, damit tRNA die native Konformation
beibeh\"alt. Prominentestes Kation ist in diesem Zusammenhang
Mg$^{2+}$. Es bindet sehr stark und kooperativ. Die Anzahl von
Anlagerungsstellen variiert von tRNA zu tRNA. In Hefe tRNA$^{Phe}$
befinden sie sich in den nichthelikalen loop Regionen.

\section{RNA Struktur und katalytische Aktivit\"at}

Bevor wir uns abstrakteren Dingen zuwenden, verweilen wir noch etwas
bei der deskriptiven Behandlung von RNA Strukturmotifs und setzen
diese in Zusammenhang mit katalytischen und chemischen
Wechselwirkungen. Die Motivation daf\"ur ist nicht zuletzt, dass wir
die evolution\"are Perspektive auf der molekularen Ebene nicht
vergessen sollten. Nach der Entdeckung, dass bestimmte RNAs in
Strukturen falten k\"onnen die katalytisch aktiv sind, h\"alt die
Spekulation dar\"uber an, dass RNA Katalyse eine entscheidende Rolle
in der Entstehung fr\"uher Selbst-Replikation und sequenz-gesteuerter
Protein-Synthese gespielt haben muss.

Katalytisch aktive RNAs nennt man auch ``Ribozyme'' (nach Kruger
1982).  Die Fragen sind: Wie bilden diese RNAs ein aktives Zentrum
aus? Um welche chemischen Reaktionen dreht es sich und wie werden sie
katalysiert?

Da gibt es zun\"achst ``grosse'' Ribozyme wie group I und group II
Introns und die katalytische RNA Untereinheit der RNase P, sowie
``kleine'' Ribozyme wie ``hammerheads''. Es stellt sich die Frage ob
eine Mindestl\"ange erforderlich ist, damit eine RNA eine stabile
katalytisch aktive Struktur {\em in Abwesenheit\/} des Substrats
aufrechterhalten kann.  Grosse Ribozyme k\"onnten unabh\"angig vom
Substrat eine ``fixe'' Struktur haben, w\"ahrend kleine Ribozyme ihre
aktive Form m\"oglicherweise nur nach Bindung mit dem Substrat
erhalten. Die Frage ist offen.

Die Unterscheidung nach Gr\"osse scheint auch im Hinblick auf den
chemischen Mechanismus Sinn zu machen: die drei grossen Ribozyme
erzeugen bei der Spaltung von RNA $3'$ Hydroxyl-Enden, w\"ahrend die
kleinen $2'$,$3'$ zyklische Phosphat-Enden in den Produkten zur\"ucklassen.

Group I introns enthalten einige Abschnitte invarianter
Nukleotide. Alle bekannten group I Sequenzen lassen sich in
Sekund\"arstrukturen falten, die eine gemeinsame ``core'' Region
besitzen. An dieser sind die helikalen Bereiche P3, P4, P6 und P7
(siehe Abbildung) beteiligt. Man beachte den helikalen Bereich aus
Pseudoknoten.

In der Spleiss-Reaktion schneidet das Intron sich selbst aus dem RNA
Transkript heraus. Die group I Reaktion l\"auft in zwei Phasen ab: (1)
nukleophiler Angriff der $3'$ OH Gruppe eines exogenen Guanosins auf
den $5'$-seitigen Spleiss-Punkt. Damit wird die Kette geschnitten. Man
beachte, dass nach diesem Schritt das exogene G nun am $5'$ Ende des
Introns h\"angt. (2) Der $5'$ seitige Spleiss-Punkt wird mit dem $3'$
seitigen Spleiss-Punkt ligiert und setzt dabei die Intron-Sequenz
frei. Die $5'$ seitige Spleiss-Stelle befindet sich in der gepaarten
Region P1, d.h. ein kurzes Segment des $5'$ Exons ist bis zur
Spleiss-Stelle mit dem katalytisch aktiven Intron gepaart. Genau
dieser Sachverhalt verleiht dem Intron Spezifizit\"at. Manchmal
enth\"alt diese Region am Intron auch einen kurzen Abschnitt der zur
$3'$ Spleiss-Stelle komplement\"ar ist. Damit k\"onnen die zu
ligierenden Enden zusammengehalten werden. Manche group I Introns
ben\"otigen Proteine um ihre Spleiss-Aktivit\"at zu entfalten. Diese
Proteine k\"onnen sogar im Intron selbst codiert sein. In allen
bekannten F\"allen ist aber der Reaktionsablauf der gleiche.

Group I Introns wurden in verschiedenen Eukaryoten gefunden (precursor
Transkripte f\"ur mRNA, rRNA, tRNA), aber auch in Eubakterien.  In
manchen {\em Tetrahymena\/} Spezies befinden sich group I Introns in
den Genen der rRNA der grossen ribosomalen Untereinheit. Es ist
bemerkenswert, dass in diesen Spezies der phylogenetische Baum des
group I Introns verschieden ist von den
Verwandtschaftsverh\"altnissen, die man aufgrund der rRNA Vergleiche
erh\"alt. Die Verbreitung von group I Introns ist m\"oglicherweise
nicht nur auf konventionelle Vererbungskan\"ale beschr\"ankt.

Group II Introns sind ebenfalls durch eine gemeinsame Struktur
definiert.  Es scheinen allerdings weniger Nukleotide konserviert zu
sein als im group I Fall. Viele group II Introns k\"onnen sich {\em in
vitro\/} selbst spleissen, allerdings nur unter unphysiologischen
Bedingungen.  Das zeigt aber immerhin dass die Reaktion allein von der
RNA durchgef\"uhrt werden kann. Um die Spleiss-reaktion {\em in
vivo\/} zu erhalten sind Proteinkomponenten n\"otig. Der
Spleissmechanismus ist den group I Introns im Prinzip
\"ahnlich. Auffallendster Unterschied ist das Nukleophil: es handelt
sich um ein {\em endogenes\/} Adenin ist. Daraus folgt, dass das
Intron beim nukleophilen Angriff zyklisiert wird; man nennt es dann
ein ``lariat'' Intron. Alle bekannten group II Introns wurden in
eukaryotischen Organellen gefunden.

Von den grossen katalytischen RNAs gleicht die M1-Untereinheit der
RNase P am ehesten einem Enzym - im Sinne, dass es ``umsetzt'', oder
einen ``turn over'' erzeugt. Die Reaktion, die durch RNase P
katalysiert wird, besteht in der Entfernung einer Sequenz vom $5'$
Ende eines tRNA precursors. RNase P spaltet durch Hydrolyse und
erzeugt $5'$ Phosphat Enden und $3'$ OH Enden. Das ist dieselbe
chemische Spezifizit\"at der group I und II Introns; die meisten
Ribonukleasen spalten mit umgekehrter Spezifizit\"at. Das Holoenzym
besteht aus einer 377 Nukleotide langen RNA und einem 14 kD
Polypeptid. Das Protein ist f\"ur {\em in vivo\/} Funktionalit\"at
erforderlich.  Die RNA-Untereinheit reicht aber zur Katalyse unter
hohen Salzkonzentrationen aus. Das Polypeptid scheint die
Reaktionsbedingungen auf physiologische Werte einzustellen. Weiters
scheint das Protein den geschwindigkeitsbestimmenden Schritt bei
Mehrfachumsetzungen zu ver\"andern. Der geschwindigkeitsbestimmende
Schritt bei der RNA-only Reaktion ist die Freigabe des Produkts.

Es ist klar, dass katalytische Aktivit\"at - ``Funktion'' - mit der
r\"aumlichen Form einer RNA zusammenh\"angt. Was sich allerdings immer
mehr herausstellt ist, dass die Regeln oder Prinzipien nach denen eine
aktive Form ``gebaut'' wird sich zwischen Proteinen und RNAs stark
unterscheiden. An der Sekund\"arstruktur von Proteinen sind
Wassertsoffbr\"ucken zwischen Abschnitten des Peptidr\"uckgrates
beteiligt. Das f\"uhrt unter anderem dazu, dass die Aminos\"aure-Reste
nach ``aussen'' gewandt sind - realtiv zu den ``backbone-backbone''
Wechselwirkungen.  Die Sekund\"arstruktur der Nukleins\"auren kommt
durch Wasserstoffbr\"uckenbindung zwischen den Basen zustande und
bringt dadurch ein repetitives Phosphatr\"uckgrat an die
Aussenseite. In einem gewissen Sinn ist die Sekund\"arstruktur der
Nukleins\"auren im Vergelich zu jener der Proteine ``umgest\"ulpt'':
was bei den einen ``Innen'' ist, ist bei den anderen ``Aussen''.  Das
hat Konsequenzen im Hinblick auf die Erzeugung von Strukturen
h\"oherer Ordnung. Die Terti\"arstruktur von Proteinen entsteht durch
das Zusammen-Packen von Aminos\"aure-Seitenketten. Dieser Vorgang wird
vornehmlich durch hydrophobe Wechselwirkungen stabilisiert und auch
durch Wasserstoffbr\"ucken unterst\"utzt. Um die Terti\"arstruktur von
RNAs zu ``bauen'', m\"ussen gepaarte Regionen - helikale Elemente -
auf {\em spezifische\/} Weise zusammengebracht werden. Das erscheint
aber problematisch. Zum Einen sind die Helices Polyanionen; daher kann
der Packungsvorgang nicht durch hydrophobe Wechselwirkungen
angetrieben werden und muss zudem elektrostatische Abstossung
\"uberwinden. Zum Anderen sind Phosphatr\"uckgrate chemisch gesehen
``arm'' im Vergleich zu den Basen. Letztere sind aber in der Helix
versteckt und nur teilweise terti\"aren Wechselwirkungen zug\"anglich.
Die L\"osung des Problems besteht wie bei den Proteinen teilweise aus
Wasserstoffbr\"ucken \"uber das R\"uckgrat, Pseudoknoten, Basentripel
und dergleichen wie wir sie im Fall der tRNA kennengelernt haben. Es
gibt aber einen weiteren wichtigen Beitrag zur L\"osung des
Terti\"arstrukturproblems in RNA. Wir sind ihm fl\"uchtig bei der tRNA
schon begegnet: Metallkationen.

Es ist der Beitrag der Metallkationen, der die Protein-3D-Faltung von
der RNA-3D-Faltung unterscheidet. Die meisten Proteine falten ohne
Metallionen; mit Ausnahmen wie etwa die ``Zink-Finger''. tRNA, das
{\em Tetrahymena\/} Ribozym (group I Intron) und viele weitere
ben\"otigen Mg$^{2+}$ oder Mn$^{2+}$. Die Kationen wirken
wahrscheinlich auf der Ebene der Terti\"artstruktur eher als auf der
Ebene der Sekund\"arstruktur. Bei der tRNA scheinen die divalenten
Kationen Regionen zu stabilsieren in denen sich zwei oder mehr
Phosphatr\"uckgrate nahe kommen.

Ein weiterer Unterschied zwischen RNA- und Protein-Strukturprinzipien
ist die Autonomie der einzelnen Sekund\"arstrukturelemente. Wenn eine
$\alpha$-Helix aus ihrem Kontext im Protein herausgenommen wird,
``entfaltet'' sie sich.  Im Gegensatz dazu beh\"alt eine RNA Haarnadel
ihre Struktur h\"aufig bei. Eine Konsequenz davon ist dass man
diskrete Bestandteile der RNA Funktion individuellen
Sekund\"arstrukturelementen zuschreiben kann. Umgekehrt kann man
vielleicht eine RNA-Maschine gezielt aus Sekund\"arstrukturelementen
zusammenbauen, von denen jedes einen definierten Beitrag zur Katalyse
leistet. Wenn beispielsweise ein loop zur Metallionenbindung mit einem
loop zur Guanosinbindung richtig zusammengebracht wird, k\"onnte dies
zur Ausrichtung und Aktivierung eines Guanosinnukleophils
dienen. Obwohl dieses ``Kassettenprinzip'' der Terti\"arstruktur von
RNAs naiv ist, k\"onnte es einen n\"utzlichen Ausgangspunkt zur
Betrachtung von Struktur-Funktionsbeziehungen in RNA liefern.

Das Terti\"arstruktur-Modell vom {\em Tetrahymena\/} Ribozym ist in
der beigelegten Abbildung dargestellt und soll hier nicht weiter
ausgef\"uhrt werden.

Eine weitere Abbildung stellt die bisher bekannten Reaktionen dar, die
von Ribozymen katalysiert werden.  In der Natur wurden bisher nur
Transesterifizierungen und Hydrolyse von Phosphodiester Bindungen
gefunden. Der Spaltungsschritt verl\"auft unter Katalyse des {\em
Tetrahymena\/} Introns schneller als die Helixbildung bei
Substratanlagerung. In diesem Sinne ist die Reaktion
``diffusionskontrolliert''. Das Ribozym saturiert aber rasch, weil es
das gespaltene $5'$ Ende nur sehr langsam losl\"asst. Daf\"ur wurde es
allerdings auch selektiert...

Die grossen Ribozyme sind in der Lage auch DNA zu spalten; allerdings
verl\"auft die Reaktion um einige Gr\"ossenordnungen langsamer. Dass
sie \"uberhaupt m\"oglich ist, ist einzusehen, da der nukleophile
Angriff bei den grossen Ribozymen nie das $2'$ OH direkt
miteinschliesst. Trotzdem beeinflusst die Hydroxylgruppe
offensichtlich die Reaktivit\"at auf indirekte Weise stark.

Die kleinen Ribozyme, wie ``hammerhead'' und hepatitis $\delta$ - eine
Satelliten RNA des Hepatitis B virus -, stellen RNA Struktur-Motive
dar, die RNA Spaltungsreaktionen katalysieren. Sie treten in RNAs von
bestimmten pathogenen Pflanzen Viren auf. Die Spaltung hinterl\"asst,
wie bereits erw\"ahnt, ein $2'$,$3'$ zyklisiertes Phosphat Ende.
Wiederum sind divalente Metallkationen wesentlich an der Funktion
beteiligt. Es soll nicht der Eindruck entstehen, dass RNA Katalyse im
Gegensatz zu proteinvermittelter Katalyse ``schlampig'' sei.  Ebenso
wie bei tRNA und den grossen Ribozymen verlangt die Aktivit\"at der
kleinen Ribozyme die Erf\"ullung pr\"aziser geometrischer
Anforderungen.

\subsection*{RNA Strukturelemente und Funktion}

Abschliessend fassen wir kurz die Strukturelemente der RNA und einige
ihrer Funktionen zusammen.

{\bf doppelstr\"angige helikale Abschnitte}

$\bullet$ Sie bewirken thermodynamisch die Strukturbildung, und sind
indirekt Ursache f\"ur die Entstehung aller anderen Strukturelemente.
$\bullet$ Stabilisieren Terti\"arstruktur (rRNA, RNase P RNA, group I
self-splicing introns). $\bullet$ Spezifizit\"at in der Katalyse.
Erkennung eines spezifischen RNA Substrats seitens einer katalytischen
oder strukturellen RNA erfolgt weitgehend \"uber komplement\"are
Helix-Bildung (Spliceosomen, Translation von mRNA - Shine/Dalgarno,
anticodon Erkennung, group I introns, antisense Regulation) $\bullet$
Wechselkwirkung mit bestimmten Proteinen: vor allem solchen, die
helikale Abschnitte schmelzen.

{\bf hairpin loops}

$\bullet$ Besonders stabile ``Tetraloops'', bestehend aus spezifischen
Tetraoligonukleotiden.  Die zwei mittleren Nukleotide haben C$_{2'}$
{\em endo\/} pucker. $\bullet$ Zwei Klassen: solche mit definierter
rigider Struktur, und solche mit flexibler Struktur. $\bullet$
Beteiligt an der Initiation, Propagation, und Termination der
Translation. Attenuations-Kontrolle. $\bullet$ Kontrolle der mRNA
Halbwertszeit. $\bullet$ Pausieren der Ribosome.  Frameshifting.
$\bullet$ Kontakte mit Proteinen. $\bullet$ Spezifische Erkennung -
f\"allt auch in die Kategorie ``doppelstr\"angige Helices'', denn die
Bildung gepaarter Regionen impliziert die Bildung ungepaarter
(loop-)Regionen.

{\bf internal loops}

$\bullet$ Kontakte mit Proteinen. Bindung ribosomaler Proteine.

{\bf bulges} (einseitige Ausbuchtungen)

$\bullet$ Knicke in der Terti\"arstruktur. $\bullet$ Bereitstellung
eines Nukleophils in katalytischer Aktivit\"at (herausgebuchtetes
Adenosin in group II introns).

{\bf Pseudoknoten}

$\bullet$ Haben A-Form Geometrie. $\bullet$ tRNA Mimicry bei der RNA
von Pflanzen-Viren. $\bullet$ Frameshifting bei der Translation
retroviraler mRNAs. $\bullet$ Protein-Bindungsstellen.

\section{Die Kombinatorik der Sekund\"arstruktur}

Die Prim\"arstruktur einer einzelstr\"angigen RNA ist eine lineare
Sequenz ${\bf a} = a_1a_2\ldots a_n$, mit $a_i\in\{{\bf A},{\bf
U},{\bf G},{\bf C}\}$.  Formal gesehen ist die Sekund\"arstruktur ein
Graph, dessen Knoten die Basen sind und dessen Kanten die Kontakte
zwischen den Basen ausdr\"ucken. Dabei gibt es zwei Arten von
Kontakten: (1) die Phosphat-Verbindungen zwischen den Basen, die das
R\"uckgrat ausmachen, und (2) die Menge der Basenpaare.  Menge (1) ist
uninteressant, weil sie ohnehin durch die Sequenz festgelegt ist.  Es
ist die Menge der Basenpaare, Menge (2), die eine Sekund\"arstruktur
charakterisiert. Eine Sequenz kann n\"amlich viele m\"ogliche
Basenpaarungen (Sekund\"arstrukturen) einnehmen. Diese werden sich
zwar energetisch unterscheiden, aber damit wollen wir uns noch nicht
befassen.

\begin{defn}\label{ss}
Eine Sekund\"arstruktur besteht aus einer Knotenmenge $V=\{1,
2,\ldots,i,\ldots,N\}$ und einer Menge $S$ von Kanten $i\cdot j$, $1
\le i < j \le N$, derart, dass \\ (i) (R\"uckgrat) $\forall\; i<n\;
i\cdot (i+1) \in S$, und\\ (ii) (bin\"are Paarungen) f\"ur jedes $i$
gibt es h\"ochstens ein $k\ne i-1,i+1$ f\"ur das $i\cdot k\in S$,
und\\ (iii) (Basenpaare ohne Pseudoknoten) falls $i\cdot j\in S$ und
$k\cdot l\in S$ und $i < k < j$, dann gilt $i < l < j$.
\end{defn}

Die Knotenmenge steht einfach f\"ur die Menge der Positionen einer
Sequenz der L\"ange $N$. Man beachte, dass die Kantenmenge das
R\"uckgrat der Kette, d.h. Kontakte zwischen entlang der Kette
benachbarten Basen, miteinschliesst. Die Kantenmenge besteht also aus
R\"uckgrat + Basenpaare.  Wir wollen aber in Hinkunft das triviale
R\"uckgrat vergessen und so tun als bezeichne $i\cdot j$ ein
Basenpaar. Dabei ist es n\"utzlich ein b\"urokratisches Detail zu
bemerken: die obige Definition schliesst Basenpaarung zwischen
aufeinanderfolgenden Positionen $i$ und $i+1$ aus. Das ist deshalb der
Fall, weil Positionen $i$ und $i+1$ immer durch eine R\"uckgrat-Kante
verbunden sind und die Definition keinen Unterschied zwischen
R\"uckgrat-Kante und Basenpaar-Kante macht. Das ist aber v\"ollig
egal, weil es ohnehin sterisch nicht sinnvoll ist $i$ und $i+1$
miteinander paaren zu lassen. Wenn man dies jedoch zul\"asst und dazu
noch das triviale R\"uckgrat vergisst, k\"onnte die Definition etwas
einfacher aussehen: Eine Sekund\"arstruktur ist eine Menge von
Basenpaaren (ohne Pseudoknoten): $S' = \{ i\cdot j | \forall i\cdot
j\; \not\exists\; k\cdot l\quad i \le k \le j \le l\}$

Die Definition f\"allt deshalb etwas schwerf\"allig aus, weil sie
Pseudoknoten ausschliesst. Der Ausschluss von Pseudoknoten entspricht
dem \"ublichen Begriff der Sekund\"arstruktur. Dieser Begriff ist
durchaus sinnvoll - wie wir bereits in den vorangegangenen Abschnitten
gesehen haben. Man beachte ferner, dass die Sekund\"arstruktur ein
topologischer Begriff ist.  Er bringt zum Ausdruck welche Position
welcher benachbart ist.  Es wird gar nichts dar\"uber ausgesagt wie
weit eine Position von einer anderen entfernt ist.  Dies sollte man
stets gegenw\"artig halten, insbesondere bei Betrachtung graphischer
Darstellungen der Sekund\"arstruktur, die einen verleiten k\"onnen
anzunehmen es handle sich um die ``2D-Darstellung'' einer
Struktur. Das ist nicht der Fall!

In der formalen Definition \ref{ss} einer Sekund\"arstruktur wird
offengelassen was man unter ``Basenpaar'' versteht. Die Definition
macht selbst dann Sinn wenn jede Base mit jeder paaren kann.
\"Ublicherweise f\"ugt man eine Liste zugelassener Paarungen hinzu.

Bleiben wir zun\"achst bei der uneingeschr\"ankten Definition
\ref{ss}, d.h. ignorieren wir die spezifische Basensequenz einer RNA
Kette und lassen Paarungen zwischen beliebigen Nukleotidsorten zu.
Die Frage, die sich dabei aufdr\"angt, lautet: Wie viele
unterschiedliche Sekund\"arstrukturen - d.h. unterschiedliche
Topologien - gibt es f\"ur eine Kette der L\"ange $N$? Das wollen wir
uns n\"aher ansehen, weil man damit ein Gef\"uhl f\"ur den ``rekursiven''
Aufbau einer Struktur erh\"alt.

Sei die gesuchte Anzahl an Sekund\"arstrukturen der L\"ange $n$,
$S(n)$.  Wenn $n=0$, erlauben wir uns einfach zu definieren:
$S(0)=1$. F\"ur $n=1$ und $n=2$ ist sofort klar, dass $S(1)=1$.
Ein direktes Abz\"ahlen wird bald sehr frustrierend. Versuchen wir
also ein Verfahren zum Abz\"ahlen zu entwickeln. Nehmen wir an, wir
kennen die Zahl der Strukturen f\"ur alle L\"angen bis zur L\"ange
$l$, $S(k), 1\le k \le l$.  Verl\"angern wir nun die Kette $[1,l]$ um
eine Position zur Kette $[1,l+1]$.  Wir k\"onnen dann die Zahl der
Strukturen auf $[1,l+1]$ durch die bekannte Zahl von Strukturen auf
Teilsegmenten ausdr\"ucken.

Es gibt zwei M\"oglichkeiten f\"ur das neu hinzugekommene Nukleotid
$l+1$: Entweder $l+1$ ist nicht gepaart, oder es paart mit einer
Position $j$, wobei $1\le j \le l-1$.

Wenn $l+1$ nicht gepaart ist, dann gibt es $S(l)$ Strukturen, die das
Segment $[1,l]$ annehmen kann.

Nehmen wir nun an, $l+1$ paare mit Position $j$. Durch diese Paarung
entstehen zwei Teilsegmente $[1,j-1]$ (L\"ange $j-1$) und $[j+1,l]$
(L\"ange $l-j$), die beide ihren eigenen unabh\"angigen Satz an
Strukturen einnehmen k\"onnen, n\"amlich $S(j-1)$ und $S(l-j)$. Jede
Struktur auf einem Segment ist mit jeder Struktur auf dem anderen frei
kombinierbar und ergibt eine m\"ogliche Struktur auf der Gesamtkette,
insgesamt also $S(j-1)S(l-j)$. Das gilt aber f\"ur jedes m\"ogliche
$j$, $1\le j \le l-2$.

Was wir gerade hergeleitet haben, k\"onnen wir gleich als Theorem zusammenfassen:
\begin{thm}\label{countS}
F\"ur die Zahl $S(l+1)$ der Sekund\"arstrukturen einer Kette der
L\"ange $l+1$ gilt:
\[
S(l+1) = S(l) + \sum_{j=1}^{l-1} S(j-1)S(l-j)
\]
\end{thm}

Auf diese Weise kann man rekursiv die Zahl der Sekund\"arstrukturen
bestimmen: $1,1,2,4,8,17,37,82,185,\ldots$.  F\"ur eine Kette der tRNA
L\"ange $N=76$ m\"ussten wir sukzessive $S(1)$, $S(2)$, usw. bis
$S(75)$ ausrechnen um dann endlich $S(76)$ zu bestimmen.  

Wenn wir die Definition $S'$ benutzen, in der Basenpaarung zwischen
$i$ und $i+1$ zugelassen ist, dann k\"onnen wir mit (fast) elementarer
Kombinatorik eine exakte Abz\"ahlung durchf\"uhren. Das wollen wir des
p\"adagogischen Wertes wegen auch tun.

Verglichen mit $S(l+1)$ \"andert sich nur die Summationsobergrenze:
$S'(l+1) = S'(l)+\sum_{j=1}^{l} S'(j-1)S'(l-j)$. Die Beziehung
zwischen $S(l+1)$ und $S'(l+1)$ ist wegen der Rekursion dennoch nicht
einfach.\\ (1) Zun\"achst stellen wir fest dass $S'(n) =
\sum_{k=0}^{\lfloor n/2 \rfloor} S'(n,k)$ ist, wobei $S'(n,k)$ die
Zahl der Sekund\"arstrukturen von Ketten der L\"ange $n$ mit genau $k$
Basenpaaren ist.\\ (2) $S'(n,k)$ l\"asst sich auf folgende Weise
berechnen. Wir stellen eine Sekund\"arstruktur als eine Folge von
Punkten (ungepaarte Positionen) und gepaarten Klammern (gepaarten
Positionen) dar, beispielsweise $...((..))..(((..(.))..))$ Eine
Sekund\"arstruktur mit $k$ Basenpaaren hat nat\"urlcih $k$
Klammernpaare.  Wir vergessen vorl\"aufig die $n-2k$ Punkte ($n$ ist
die Kettenl\"ange) und fragen wieviele Anordnungen von $k$
Klammernpaaren gibt es? Die Frage ist identisch mit der Frage nach den
m\"oglichen vollst\"andigen Klammerungen eines Produkts mit $n+1$
Termen, $a_0\cdot a_1\cdot\ldots\cdot a_n$. Die Antwort sind die
Catalan Zahlen:
\[
\frac{1}{k+1}\binom{2k}{k}\qquad (\sim 4^k\cdot k^{-3/2})
\]
Jetzt m\"ussen wir noch die $n-2k$ Punkte unterbringen.  Betrachten
wir eine Klammeranordnung, etwa $((()))()$, dann k\"onnen wir Punkte
vor jeder aufgehenden und vor jeder zugehenden Klammer einsetzen,
sowie am Ende der Klammeranordnung. Insgesamt sind das $2k+1$
Pl\"atze.  Wir wissen (oder k\"onnen leicht ableiten) dass die Zahl
der M\"oglichkeiten $a$ (ununterscheidbare) Objekte auf $b$ Schachteln
zu verteilen $\binom{a+b-1}{a}$ ist (Bose-Einstein!).
Im vorliegenden Fall m\"ussen wir $n-2k$ Punkte auf $2k+1$ Pl\"atze verteilen.
Das gibt
\[
\binom{n-2k+2k+1-1}{n-2k}=\binom{n}{n-2k}
\]
M\"oglichkeiten pro Klammeranordnung. Insgesamt also:
\[
S'(n) = \sum_{k=0}^{\lfloor n/2 \rfloor}\frac{1}{k+1}\binom{2k}{k}\binom{n}{n-2k}
\]

Kehren wir zu Theorem \ref{countS} zur\"uck.  F\"ur diese Rekursion
l\"asst sich eine asymptotische Formel angeben. Die Herleitung der
Asymptotik erfolgt \"uber erzeugende Funktionen,
$\phi(x)=\sum_{k\ge0}S(k)x^k$, und ben\"otigt einige Tricks, die hier
zu erl\"autern uns zu lange besch\"aftigen w\"urde. (Daher r\"uhrt der
p\"adagogische Wert der vorigen Abz\"ahlung :-) Das Egebnis lautet:
\begin{thm} \label{asymp}
F\"ur $n\rightarrow\infty$ ist die Zahl $S(n)$ der Sekund\"arstrukturen:
\[
S(n) \sim
\sqrt{\frac{15+7\sqrt{5}}{8\pi}}\;n^{-3/2}\;\left(\frac{3+\sqrt{5}}{2}\right)^n
\approx 1.1 \;n^{-3/2}\;2.6^n
\]
\end{thm}

F\"ur eine bescheidene 5S RNA mit 120 Nukleotiden sind das etwa
$1.2\cdot 10^{47}$ verschiedene Sekund\"arstrukturen.  Wir wollen uns
aber nicht von den Zahlen ablenken lassen. Wir stellen fest, dass die
Zahl der Strukturen exponentiell in der Kettenl\"ange ist. Nun, das
war irgendwie zu erwarten. Das Interessante aber an der asymptotischen
Formel ist der Term $2.6^n$ im Vergleich zu $4^n$ - die Zahl der
Sequenzen der L\"ange $n$ mit 4 Buchstaben. Die Asymptotik sagt uns,
dass es viel weniger Strukturen gibt als Sequenzen! Man vergesse
nicht, dass Theorem \ref{asymp} die Strukturen z\"ahlt {\em ohne
Einschr\"ankung durch Basenpaarregeln}.  Jede Position kann mit jeder
paaren (ausgenommen benachbarte, s.o.). Die Zahl ist also eine
(schlechte) obere Schranke zu dem was tats\"achlich biophysikalisch
realisiert werden kann. Wenn man davon ausgeht, dass nur Energieminima
eingenommen werden, dann wird diese Zahl noch weiter sinken.

Ein stochastischer Ansatz bei dem wir die Watson-Crick Regeln
ber\"ucksichtigen liefert eine interessante Verfeinerung des obigen
Resultats.  Wir erzeugen eine RNA-Sequenz der L\"ange $n$ mit den
Nukleotid-Wahrscheinlichkeiten $p_A,p_U,p_G,p_C$. Die
Wahrscheinlichkeit, dass zwei beliebig herausgegriffene Positionen
miteinander paaren k\"onnen ist $p=2(p_Ap_U + p_Gp_C)$ Sei
$\eta_{ij}=1$, wenn $i$ mit $j$ paaren kann, $0$ sonst. Offensichtlich
ist der Erwartungswert $\langle\eta_{ij}\rangle=p$. Sei nun $R(n)$ eine
Zufallsvariable, die die Zahl der Sekund\"arstrukturen einer
Zufallssequenz der L\"ange $n$ bezeichnet.  Wir erhalten ganz analog zur vorangehenden
\"Uberlegung:
\[
R(n+1) = R(n) + \sum_{j=1}^{n-1} R(j-1)R(n-j)\eta_{l+1,j}
\]
Wobei die Multiplikation mit $\eta_{l+1,j}$ daf\"ur sorgt, dass nur jene
Produkte von Teilsegmenten eingehen f\"ur die Position $l+1$
tats\"achlich mit Position $j$ paaren kann.  Wir bilden nun den
Erwartungswert (man beachte, dass die Teilsegmente unabh\"angig sind)
\[
\langle R(n+1)\rangle = \langle R(n)\rangle + \sum_{j=1}^{n-1} \langle
R(j-1)\rangle\langle R(n-j)\rangle p
\]
F\"ur diese Rekurrenz ist eine analoge asymptotische Berechnung
m\"oglich.  Das Resultat liefert dabei eine \"ahnliche exponentielle
Abh\"angigkeit von $n$ wie vorhin.  Im Fall dass alle Nukleotide
gleichverteilt sind, $p=1/4$, lautet der exponetielle Term:
$1.86^n$. Diese Absch\"atzung ist interessant, weil sie zeigt, dass
die (mittlere) Zahl der Sekund\"arstrukturen f\"ur Sequenzen der
L\"ange $n$ sogar kleiner ist als die Zahl $2^n$ der Sequenzen \"uber
dem kleinst-m\"oglichen Alphabet, einem bin\"aren Alphabet.

Jede RNA Sequenz der L\"ange $n$ muss also irgendeine der h\"ochstens
$2.6^n$ (oder stochastisch $1.86^n$) m\"oglichen Sekund\"arstrukturen
annehmen. Das heisst: viele Sequenzen werden in diesselbe
Sekund\"arstruktur falten. Man beachte, dass diese
Sequenz/Struktur-Entartung anders ausfallen wird, je nach dem wie man
``Struktur'' definiert. Wenn wir unter ``Struktur'' die exakten
3D-Koordinaten jedes Atoms in einer RNA verstehen, dann haben keine
zwei Sequenzen dieselbe Struktur. Eine solcherart definierte Struktur
ist nat\"urlich sehr schwierig (wenn \"uberhaupt) zu berechnen. Er ist
aber andererseits f\"ur eine Reihe von Fragen (auf die wir sp\"ater
noch kurz zu sprechen kommen) gar nicht n\"otig.  Wie sich aus den
Beispielen der Vortage zeigt, kann man biologische Funktionalit\"at
bereits mit einem wesentlich weniger detailliertem, extrem groben
Strukturbegriff -- wie dem der Sekund\"arstruktur -- sinnvoll
korrelieren.  Halten wir also fest, dass es nicht nur einen einzigen
n\"utzlichen Strukturbegriff gibt, sondern eine Reihe sinnvoller
Abstraktionen. ``Sinnvoll'' heisst hier eine Mischung aus ``hat
Erkl\"arungswert'', ``ist empirisch zug\"anglich'', ``kann berechnet
werden''.

Es ist klar, dass nicht alle Sekund\"arstrukturen dieselbe freie
Bildungsenergie aufweisen werden. Einige Strukturen werden stabiler
sein als andere.  Wegen der stacking Wechselwirkungen wird
beispielsweise eine vollst\"andig gepaarte Haarnadel stabiler sein als
eine Struktur mit einem einzigen isolierten Basenpaar. Wir wenden uns
nun der Berechnung einer energetisch optimalen Sekund\"arstruktur
einer beliebigen RNA Sequenz zu.

Zur Vorbereitung soll eine kurze Betrachtung eingeschaltet werden, die
das Prinzip nach dem vorgegangen wird, verdeutlicht.  Statt die
Sekund\"arstruktur mit niedrigster Energie zu suchen, wollen wir ein
Verfahren angeben um zu einer gegebenen Sequenz eine
Sekund\"arstruktur mit der maximal m\"oglichen Anzahl von Basenpaaren
zu finden.  Zu diesem Zweck brauchen wir eine Matrix, die uns angibt
welche Basenpaare erlaubt sind, z.B. $A\cdot U$, $C\cdot G$, $U\cdot
A$ usw. Sei das Alphabet ${\cal A}=\{A,U,G,C\}$ und $a,b\in{\cal A}$,
dann wollen wir:
\[
\rho(a,b) = 
\begin{cases}
1 & \text{wenn $a$ und $b$ paaren k\"onnen},\\
0 & \text{sonst}.
\end{cases}
\]
Wir stellen nun eine \"Uberlegung an, der wir bereits bei der
Herleitung der Rekursionsformel f\"ur die Anzahl an
Sekund\"arstrukturen begegnet sind. Sei eine Nukleotidsequenz
$a_1a_2\cdots a_n$ mit $a_i\in{\cal A}$ gegeben.  Bezeichne ferner
$X_{i,j}$ die maximale Zahl an Basenpaaren im Teilsegment $[i,j], i<j$
(also der Teilsequenz $a_ia_{i+1}\cdots a_j$). Nehmen wir weiter an
wir kennen $X_{i,j}$ und wollen $X_{i,j+1}$ berechnen, d.h. wir
h\"angen das $j+1$-te Nukleotid an das $3'$ Ende des bereits
berechneten Segments und erzeugen das Segment $[i,j+1]$.  Wir gehen
nun alle m\"oglichen Wechselwirkungen durch, die das Nukleotid
$a_{j+1}$ eingehen kann. Die Position $j+1$ kann im Prinzip mit jeder
Position $l$, $i\le l <\le j-1$ wechselwirken. Ob sie paaren kann,
sagt uns das Matrixelement $\rho(a_{j+1},a_l)$. Wenn das Nukleotid an
der Stelle $j+1$ mit dem an der Stelle $l$ paaren kann, dann wird das
Segment $[i,j+1]$ in zwei unabh\"angige (keine Pseudoknoten!)
Teilsegmente $[i,l-1]$ und $[l+1,j]$ gespalten. Wenn $X_{i,l-1}$ und
$X_{l+1,j}$ die maximale Anzahl an Basenpaaren auf den entsprechenden
Teilsegmenten bezeichnen, dann ist die Gesamtzahl an Basenpaaren auf
dem Segment $[i,j+1]$ im Fall dass $l$ und $j+1$ paaren, genau $1 +
X_{i,l-1} + X_{l+1,j}$. Wir gehen alle F\"alle f\"ur $i\le l \le j-1$
durch und behalten den Maximalwert. Diesen vergleichen wir
schliesslich mit $X_{i,j}$ und der gr\"ossere der beiden ist der Wert
f\"ur $X_{i,j+1}$.  Der letzte Vergleich ist n\"otig, weil es ja sein
k\"onnte, dass eine Paarung von $j+1$ wegen der Aufspaltung in
Segmente uns im Endeffekt Basenpaare kostet - jene n\"amlich die vorher
zwischen diesen Segmenten m\"oglich waren; es k\"onnte also besser
sein $j+1$ gar nicht paaren zu lassen. Wir fassen nun diesen
Verbalexzess zusammen:
\[
X_{i,j+1} = \max \{X_{i,j}, \max_{i\le l \le j-1}\{[X_{i,l-1} + 1 +
X_{l+1,j}]\rho(a_l,a_j+1)\}\}
\]
Wir m\"ussen aber noch eine Annahme einl\"osen, die wir immer wieder
gemacht haben.  Wir haben so getan als w\"aren die $X_{p,q}$ der
Teilsegmente schon berechnet worden bevor wir sie brauchten.  Genauer:
wenn wir $X_{i,j}$ berechnen, brauchen wir in der ($i\le l \le
j-1$)-Schleife alle Eintragungen $X_{p,q}$ mit $i\le p < q \le j-1$.
Der Witz ist, dass man die $n\times n$ Matrix der $X_{p,q}$ Werte so
auff\"ullen kann, dass wir nie auf Eintragungen zugreifen, die noch
nicht berechnet worden w\"aren. (Es handelt sich \"ubrigens nur um
eine H\"alfte der Matrix, da nur jene $X_{p,q}$ einen Sinn haben f\"ur
die $p < q$ ist). Beispielsweise kann man von der Hauptdiagonalen her
alle Nebendiagonalen auff\"ullen, d.h. zun\"achst werden alle Segmente
$[i,i+2], i \le 1 \le n-2$ berechnet, dann alle Segmente $[i, i+3], i
\le 1 \le n-3$, usw.  bis zum letzten - dem gesuchten - Segment
$[1,n]$.

Wenn die Prozedur beendet ist, haben wir eine Zahl: die maximal
m\"ogliche Zahl $m$ an Basenpaarungen. Wir h\"atten aber gern auch
eine Liste dieser Paare, d.h. eine Sekund\"arstruktur mit $m$
Basenpaaren. Das ist leicht, denn wir haben nicht nur eine Zahl
ausgerechnet, sondern auch eine ganze Tabelle von $X_{i,j}$.  Wir
drehen jetzt einfach den Algorithmus um: Wir starten mit dem Segment
$[1,n]$ (der gesamten Kette) und schauen in der Tabelle nach wie wir
auf diese Zahl gekommen sind, d.h. welche Segmentierung in die
Teilketten $[1,l-1]$ und $[l+1,n-1]$ den Wert $X_{1,n}$ geliefert hat.
Wenn eine Segmentierung gefunden wurde, dann war daf\"ur das Paar
$l\cdot k$ verantwortlich und wir nehmen es in die Liste auf.  Genauso
verfahren wir mit den Teilsegmenten $[1,l-1]$ und $[l+1,n-1]$ bis
nichts mehr \"ubrigbleibt. Die so erhaltene Liste ist nicht
notwendigerweise die Einzige mit der maximalen Zahl an Paarungen.  Es
wird im allgemeinen viele entartete optimale L\"osungen geben. Was wir
mit dieser Prozedur getan haben, ist {\em eine\/} dieser optimalen
L\"osungen zu generieren. Dieses Verfahren, eine Tabelle, die durch
einen Algorithmus aufgef\"ullt wurde, durch Umkehr desselben
Algorithmus zu durchschreiten nennt man ``backtracking''. Das geht
sehr schnell.

Diese Strategie eine Tabelle aufzuf\"ullen heisst ``dynamic
programming''.  Dynamic Programming ist eine ausserordentlich wichtige
und vielseitig anwendbare Technik um Optimierungsprobleme zu l\"osen,
indem L\"osungen zu Teilproblemen gefunden werden und diese dann zur
Gesamtl\"osung zusammengef\"ugt werden. Das Wort ``programming''hat
hier {\em nichts\/} mit der Erstellung von Computer-Code zu tun,
sondern bezeichnet lediglich das Auff\"ullen einer Tabelle;
``programming'' heisst hier soviel wie ``Tabellierung''. Das Prinzip
stammt halt aus einer Zeit wo der Unterschied noch nicht so
offenkundig war...

Es ist lehrreich die Zahl der Schritte grob abzusch\"atzen, die dieser
Algorithmus ben\"otigt.  F\"ur jedes $i$ und jedes $j$, $i < j$,
durchlaufen wir eine Schleife $j-i-1$ mal (das $\max_{i\le l \le j-1}$
in der obigen Gleichung). Das k\"onnen maximal $n$ Schritte sein.  Das
tun wir aber f\"ur jedes $i$ und jedes $j$. Das sind wiederum
ordnungsm\"assig $n^2$ Schritte.  Insgesamt also $n^3$. Das ist
beachtlich, wo wir doch vorhin ausgerechnet haben, dass die Gr\"osse
unseres Suchraums - das ist die Anzahl m\"oglicher
Sekund\"arstrukturen - der Ordnung $c^n$ - also exponentiell ist! Mit
einem naiven Vergleichen aller Sekund\"arstrukturen w\"aren wir
Jahrhunderte und l\"anger unterwegs. Dynamic programming hat also ein
exponentielles Problem in ein polynomiales verwandelt. Das ist keine
Magie, denn es funktioniert auch nicht bei allen
Optimierungsproblemen.

Die Anwendbarkeit von dynamic programming verlangt, dass ein
Optimierungs\-problem eine ganz bestimmte Struktur aufweist. Ein
Optimierungsproblem kann als eine Folge von Entscheidungen gesehen
werden.  In unserem Fall ging es darum zu entscheiden welche Position
mit welcher paart.  Eine {\em Folge\/} von Entscheidungen heisst eine
{\em optimale Folge\/} wenn sie folgender rekursiven Definition
gen\"ugt: Greifen wir einen Zustand in dieser Folge heraus und nennen
wir ihn den ``gegenw\"artigen Zustand''. Die Eigenschaft lautet:
unabh\"angig davon welche Entscheidungen in der Vergangenheit zum
gegenw\"artigen Zustand gef\"uhrt haben, muss relativ zu diesem
Zustand die restliche Folge von Entscheidungen auch eine optimale
Folge sein. Das bedeutet im Wesentlichen dass das Problem in
Teilprobleme zerlegbar sein muss. Das heisst nicht, dass diese
Teilprobleme voneinander unabh\"angig sein m\"ussen! Sind sie es auch
nicht: Die Probleme eine optimale Paarung auf dem Segment $[10,50]$
und eine optimale Paarung auf dem Segment $[30,70]$ zu finden, haben
etliche Teilprobleme gemeinsam. Zerlegbarkeit bedeutet hier vielmehr,
dass eine Entscheidung zum Zeitpunkt $t$ nicht die Optimalit\"at einer
vorangegangenen Entscheidung zerst\"ort. Das ist nat\"urlich weder im
Leben so, und auch nicht bei der Berechnung von echten
Molek\"ul-Konformationen, wie etwa Proteinstrukturen! Wegen der starken
Kontextabh\"angigkeit kann auch dynamic programming nicht helfen.

Im Fall der Basenpaarmaximierung ist die Zerlegbarkeit durch die
simple Additivit\"at der Basenpaaranzahlen garantiert. Das n\"utzt der
erl\"auterte Basenpaarmaximierungsalgorithmus auf einfache aber
clevere Weise aus. Die Anwendbarkeit von dynamic programming auf RNA
Sekund\"arstrukturen wurde am Ende der 70er Jahre von mehreren
gleichzeitig gesehen.

Wir sind ausreichend ger\"ustet um uns nun kurz der Bestimmung einer
energetisch optimalen Sekund\"arstruktur zuzuwenden. Im Fall der
Basenpaarmaximierung war das einzelne ``Basenpaar'' offensichtlich der
angemessene elementare Baustein in den Sekund\"arstrukturen zerlegt
werden k\"onnen. Wenn wir Energie ins Spiel kommt, ist dies nicht mehr
der Fall.  Der Grund ist ganz einfach. Z.B. hat ein Basenpaar in einem
``stack'' eine andere Energie als wenn es eine offene Schleife
abschliesst. Mit energetischen Betrachtung kommt unvermeidlich eine
gewisse Kontextabh\"angigkeit ins Spiel. Diese kann man bei RNA
Sekund\"arstrukturen in vern\"unftigen Grenzen halten. Die
Vorgangsweise besteht darin einen sinnvollen Satz von
Strukturelementen zu definieren, in die jede Sekund\"arstruktur
zerlegt werden kann und zu postulieren, dass jedes Strukturelement
additiv zur Energie der Gesamtstruktur beitr\"agt. Die Additivit\"at
ist es, die es wiederum erm\"oglicht dynamic programming anzuwenden.

Das angemessene Struktureinheit ist eine ``Schleife'' oder ein {\bf
loop}, wie wir sagen werden. Ein loop ist durch zwei Zahlen
charakterisiert: die Anzahl der Helices, die von ihm ausgehen - diese
Zahl wollen wir den ``Grad'' des loops nennen - und die Anzahl
ungepaarter Nukleotide, die er enth\"alt - seine ``Gr\"osse''.  Dabei
ist es sinnvoll Unterscheidungen zu treffen und wir wollen diese
Unterscheidungen als die ``fundamentalen Strukturelemente''
betrachten:
\begin{description}

\item[hairpin:] ist ein loop vom Grad 1 und beliebiger Gr\"osse

\item[internal loop:] ist ein loop vom Grad 2 und beliebiger Gr\"osse
(Dabei trifft man h\"aufig eine weitere Unterscheidung zwischen einem
echten internal loop, in dem beidseitig ungepaarte Nukleotide
vorkommen, und in eine ``Ausbuchtung'' (``bulge'') bei der die
ungepaarten Nukleotide nur einseitig anzutreffen sind.)

\item[stack:]
das sind zwei unmittelbar aufeinanderfolgende Basenpaare,
$i\cdot j$ und $(i+1)\cdot (j-1)$. Das ist ein loop vom Grad 2 und der Gr\"osse 0.

\item[multiloop:]
das ist ein loop mit Grad $>2$ und beliebiger Gr\"osse.

\item[externe Elemente:] Das sind die ungepaarte Abschnitte, die zu
keinem loop geh\"oren.  Etwa Segmente ungepaarter Nukleotide, die
Teilstrukturen verbinden, sowie freie $3'$ oder $5'$ Enden.  Alle
externen Elemente werden zu einem Strukturelement (variabler Gr\"osse
zusammengefasst). Man k\"onnte sich bei einer Kette $[1,n]$ ein
``virtuelles'' Basenpaar zwischen den virtuellen Positionen $0$ und
$n+1$ vorstellen. Der dadurch entstandene loop umfasst genau die
externen Elemente.

\end{description}

Weil Pseudoknoten ausgeschlossen sind und weil jede Base an
h\"ochstens einer Basenpaarung teilnehmen kann, kann jede Position
(jedes Nukleotid) in einer Sekund\"arstruktur genau einem dieser
Strukturelemente zugeordnet werden.

Wir postulieren nun, dass jedes dieser Elemente additiv einen
Energiebeitrag (der von seiner Gr\"osse und m\"oglicherweise anderen
Parametern abh\"angt) zur Gesamtenergie beitr\"agt.  Sei nun $E(S)$
die minimale Energie und $S$ die dazugeh\"orige Struktur.  Sei ferner
$i\cdot j$ ein Basenpaar von $S$ und sei $S_{ij}$ eine
Sekund\"arstruktur auf dem Teilsegment $[i,j]$. Aus der postulierten
Additivit\"at folgt, dass die Teilstruktur $S_{ij}$ ebenfalls optimal
sein muss. W\"are nicht $S_{ij}$ optimal, sondern eine andere Struktur
auf demselben Segment, sagen wir $S'_{ij}$, dann k\"onnten wir
$S_{ij}$ durch $S'_{ij}$ ersetzen und damit eine Struktur mit
geringerer Gesamtenergie als $S$ erhalten.  Das widerspricht aber
unserer Annahme, dass $S$ optimal ist! Mit anderen Worten: Unter der
Voraussetzung der Additivit\"at muss bei einer optimalen
Sekund\"arstruktur jede Teilstruktur, die von einem Basenpaar
abgeschlossen wird, ebenfalls optimal sein. Das Optimalit\"atsprinzip
-- die Voraussetzung f\"ur die Anwendbarkeit von dynamic programming
-- ist also erf\"ullt.

F\"ur jedes der oben angef\"uhrten Strukturelemente gibt es empirische
Messwerte zur freien Energie. Diese Energien sind tabelliert und zwar
in Abh\"angigkeit der Gr\"osse der Schleife, der Zahl der Helices, die
in sie m\"unden, und der Art der Basenpaare die eine Schleife
begrenzen. Solche Messungen sind nicht einfach durchzuf\"uhren und sie
sind auch nicht immer mit einer hohen Genauigkeit behaftet. Jedenfalls
sind diese Tabellen ein \"ausserst n\"utzlicher Datengrundstock, der
Sekund\"artsrukturberechnungen eine gewisse Verankerung in der
empririschen Wirklichkeit verleiht. Die stacking Energien sind dabei
die einzigen stabilisierenden Energiebeitr\"age, Schleifen sind
destabilisierend.

Die Prozedur zur Energieminimierung verl\"auft nun ganz analog wie wir
sie von der Basenpaarungsmaximierung her kennen. Der einzige
wesentliche Unterschied ist dass wir es nun mit einem gr\"osseren Satz
an elementaren Strukturbausteinen zu tun haben. Sei $e(s)$ die Energie eines
elementaren Strukturbausteins $s$ und sei $E_{i,j}$ die minimale Energie
auf dem Abschnitt $[i,j]$ wenn $i$ mit $j$ paart. Dann ist
\[
\renewcommand{\baselinestretch}{0.3}
E_{i,j}=\min_{\text{\parbox{1.8cm}{alle in Frage kom\-menden $s$}}}
\left\{ \min_{\text{\parbox{2cm}{$s$ ist ein Struk\-tur\-ele\-ment,
das durch $i\cdot j$ ab\-ge\-schlos\-sen wird}}} \{e(s) +
\sum_{\text{\parbox{1.8cm}{alle $p\cdot q$ aus\-ser $i\cdot j$, die das
Struk\-tur\-ele\-ment $s$ be\-gr\-en\-zen}}} E_{p,q}\}\right.
\]
Wir m\"ussen aber auch in Betracht ziehen, dass es energetisch
g\"unstiger sein k\"onnte $i$ und $j$ nicht paaren zu lassen, selbst
wenn sie von den Paarungsregeln her dazu imstande w\"aren.  Die
eigentliche Gr\"osse, die wir minimieren wollen ist $F_{i,j}$, die
freie Energie einer Sekund\"arstruktur auf dem Segment $[i,j]$,
unabh\"angig davon ob $i$ und $j$ paaren:
\[
F_{i,j}=\min \{E_{i,j},\; \min_{i\le h < j} (F_{i,h} + F_{h+1,j}) \}
\]
Die gesuchte Gr\"osse ist $F_{1,n}$. Wenn wir sie ermittelt haben,
verfahren wir wie oben und ``backtracken'' durch die $C_{i,j}$ und
$F_{i,j}$ Tabellen und erhalten die Liste der Basenpaare, die zur
freien Energie $F_{1,n}$ gef\"uhrt haben.

In der Praxis muss man eine Reihe von N\"aherungen einf\"uhren,
insbesondere weil es zu lange dauert nach allen m\"oglichen multiloops
zu suchen.  Es gibt auch kaum zuverl\"assige Energiemessungen f\"ur
die Vielfalt aller multiloops. Zur effizienten Suche von multiloops
ben\"otigt man mehr als nur die $C$ und $F$ Tabellen, aber das f\"uhrt
hier zu weit. Es \"andert sich aber nichts am Prinzip.

Man darf nicht vergessen, dass die so ermittelten Sekund\"arstrukturen
von einer mathematischen Minimierung resultieren. Das ist nat\"urlich
nicht der Faltungsprozess wie er {\em in vitro\/} geschieht. Es kann
sein, dass Faltungstrukturen kinetisch bestimmte Strukturen sind und
nicht notwendigerweise energetische Minima. 

Das dynamic programming Prinzip kann auch ausgen\"utzt werden, um die
Zustandssumme $Q$ \"uber die m\"oglichen Strukturen $S$, die eine
Sequenz einnehmen kann, zu berechnen:
\[
Q=\sum_{S}\exp (-F(S)/kT)
\]
Hier resultiert die Zerlegbarkeit aus der mutiplikativen
Zusammensetzung der Gesamtzustandssumme aus Teilzustandssummen auf
Teilketten.  Dies geht nat\"urlich wiederum auf die Additvit\"at der
Energien, die jetzt im Exponenten stehen, zur\"uck.  Die Zustandssume
erlaubt die thermodynamischen Wahrscheinlichkeiten einer bestimmten
Sekund\"arstruktur zu ermitteln, $P(S)=\exp(-F(S)/kT)/Q$.  Das
insofern wichtig als bei Raumtemperatur eine Sequenz nicht nur eine
Struktur minimaler freier Energie einnehmen wird, sondern im
Gleichgewicht mit einem Ensemble alternativer Strukturen \"ahnlicher
Energie stehen wird.

Aus der Zustandssumme lassen sich eine Reihe von weitern
thermodynamischen Gr\"ossen errechnen. Beispielsweise die spezifische
W\"arme $C$:
\begin{align*}
H& = kT^2\frac{\delta \ln Q}{\delta T}\\
C& = \frac{dH}{dT}
\end{align*}
Die Abh\"angigkeit $C(T)$ liefert die Schmelzkurve einer RNA.

\section{Thermodynamik der Doppel-Helix Bildung}

Um Sekund\"arstrukturen vorherzusagen, m\"ussen wir die energetischen
Beitr\"age der einzelnen Sekund\"arstruktur-Motive (Strukturelemente)
kennen. Messungen werden \"ublicherweise an Oligonukleotiden
durchgef\"uhrt. Meistens sind es optische Absorptionsmessungen oder
kalorimetrische (differential scanning calorimetry) Bestimmungen.

Die Beitr\"age einer Helix oder einer Schleife h\"angen von der
Sequenz ab. Es ist nicht m\"oglich alle Sequenzvariationen eines
Oligonukleotids, das beispielsweise 15 Nukleotide lang ist, zu
messen. Um die freie Energie der Faltung {\em beliebiger\/} Sequenzen
aus gezielten Messungen weniger Sonder-Sequenzen zu extrapolieren, hat
sich in der Praxis das ``Modell der n\"achsten Nachbarn'' gut
bew\"ahrt. Es besagt, dass sich die freie Bildungsenergie eines
gr\"osseren Strukturelements, etwa einer Helix, additiv aus den
Beitr\"agen der Wechselwirkungen zwischen n\"achsten Nachbarn in einer
Sequenz zusammensetzt. Im Fall der Helix w\"aren das die
aufeinanderfolgenden Paare (stacking) von Basenpaaren.

Das Modell der n\"achsten Nachbarn ist gerechtfertigt, weil ja der
wesentliche Beitrag zur Stabilit\"at der Struktur einer
Polynukleotidsequenz vom Basen-stacking benachbarter Basenpaare
resultiert. Im Gegensatz dazu k\"onnen hydrophobe Wechselwirkungen,
die wesentlich zur Konformation von Proteinen beitragen, nicht als
Wechselwirkungen zwischen n\"achsten Nachbarn aufgefasst werden. Es
ist also die lokale Natur des Basen-stacking, das die Resultate der
Messungen weniger F\"alle auf beliebige Sequenzen anzuwenden gestattet
und damit die Vorhersage von energetisch optimalen
Sekund\"arstrukturen erm\"oglicht.

In einer antiparallelen Doppelhelix, die nur aus Watson-Crick Paaren
besteht, gibt es 10 n\"achste Nachbarn. Warum?  Es gibt $4$
Basen, also 16 Paare aufeinanderfolgender Basen. Damit \"uberz\"ahlen
wir aber, denn: wenn wir A$(5'\rightarrow 3'$)G sagen, dann impliziert
das schon ein anderes Paar, C($5'\rightarrow 3'$)T, am
gegen\"uberliegenden Helixabschnitt, m.a.W.
\[
\begin{matrix}
\longleftarrow\\
\text{GA}\\
\text{CT}\\
\longrightarrow
\end{matrix}
=
\begin{matrix}
\longleftarrow\\
\text{TC}\\
\text{AG}\\
\longrightarrow
\end{matrix}
\]
Das ergibt $16/2=8$ Paare. Damit unterz\"ahlen wir aber, weil die
soeben angestellte Betrachtung nicht f\"ur Palindorme gilt:
A$(5'\rightarrow 3'$)T auf einem Strang impliziert dasselbe Paar
A$(5'\rightarrow 3'$)T am anderen. Mit den Watson-Crick Regeln gibt es
zwei n\"achste-Nachbarn-Palindrome, AT und GC. Also gibt es insgesamt
$8+2=10$ m\"ogliche n\"achste Nachbarn in einer antiparallelen
Doppelhelix. Das heisst, dass eine Eigenschaft $P$ einer Sequenz aus
den Eigenschaften $P_i$ ($1\le i \le 10$), die den n\"achsten-Nachbar
Wechselwirkungen intrinsisch sind, und der relativen H\"aufigkeit
$\chi_i$ dieser Wechselwirkungen zusammengesetzt werden
kann\footnote{Man braucht eigentlich weniger als 10 Parameter, denn es
gelten Relationen zwischen den $\chi_i$. So ist evidentermassen jeder
Block aufeinanderfolgender A's durch ein nicht-A am $5'$ und $3'$ Ende
begrenzt. Ergo:
\[
\chi_{AT} +\chi_{AC} + \chi_{AG} = \chi_{TA} +\chi_{CA} + \chi_{GA}
\]
Ebenso f\"ur G. Das bedeutet, dass wir in einem n\"achsten Nachbar
Modell 8 unabh\"angige Parameter haben, d.h. 8 Gr\"ossen mit diesem
Modell aus empirischen Daten herausholen k\"onnen.}.

Wie werden nun die thermodynamischen Beitr\"age solcher
``Strukturatome'' ermittelt? Hier soll das nur am Beispiel der
Helix-Bildung erl\"autert werden. Im Wesentlichen versucht man die
Gleichgewichtskonstante $K$ f\"ur die Helixbildung zwischen zwei
komplement\"aren Oligonukleotiden zu bestimmen. Den Zusammenhang mit
der Thermodynamik erh\"alt man dann \"uber die Beziehung $\Delta G =
-RT \ln K$ (und weiter mit $\Delta H = -R[\delta(\ln K)/\delta
(1/T)]_p$ und $\Delta S = (\Delta H - \Delta G)/T$).

Das Problem besteht darin die Gleichgewichtskonstante mit einer
Messgr\"osse, wie etwa der optischen Absorption, in Zusammenhang zu
bringen. Dazu ben\"otigt man eine Modellvorstellung von der
Helix-Bildung.  Das einfachste (und auch in der Praxis am h\"aufigsten
verwendete) ist das sogenannte ``Zwei-Zust\"ande-Modell'' oder auch
``all-or-none''-Modell. Es wird angenommen, dass es nur zwei
Kofigurationen f\"ur die komplement\"aren Oligonukleotide gibt:
entweder Kn\"auel-Zustand (``coil'', ``denatured'') oder Helix
(``native''). Nehmen wir einmal an unser Oligonukleotid, $M$, habe
L\"ange $N$ und sei ein Palindrom, also selbst-komplement\"ar. Das
vereinfacht die Diskussion, weil wir es nur mit einer molekularen
Spezies zu tun haben. Im Zwei-Zust\"ande-Modell bezeichne $M_2$ die
Doppelhelix-Konfiguration:
\[
M + M \leftrightarrow M_2
\]
In der kinetischen Beschreibung dieser Reaktion wird zwischen einem
Nukleationschritt, mit Gleichgewichtskonstante $\kappa$, und einem
Elongationsschritt mit Gleichgewichtskonstante $s$ unterschieden,
wobei $\kappa$ im Verh\"altnis zu $s$ ausgedr\"uckt wird:
$\kappa=\sigma s$. Die Gleichgewichtskonstante der Reaktion ist dann
einfach
\begin{equation}\label{K}
K=\kappa\cdot s^{N-1} = \frac{[M_2]}{[M]^2} = \frac{X}{2(1-X)^2\cdot C},
\end{equation}
wobei $C=2[M_2]+[M]$ die Gesamtkonzentration an Oligonukleotid ist und
$X$ die relative Anzahl gepaarter Str\"ange bezeichnet: $X=2[M_2]/C$.

Verfeinerungen des Zwei-Zust\"ande-Modells ber\"ucksichtigen mehrere
Konfigurationen zwischen getrennten Str\"angen und Doppelhelix.  Jede
dieser Konfigurationen $i$ hat eine eigene Gleichgewichtskonstante
$K_i$ (f\"ur die Bildung aus getrennten Str\"angen). Die
Gesamtreaktion von Einzelstr\"angen zu allen m\"oglichen partiell
gepaarten Konfigurationen hat die Zustandssumme $q$ als
Gleichgewichtskonstante, $q=\sum_i \exp (-\Delta G_i/RT) = \sum_i
K_i$. Die verfeinerten Modelle unterscheiden sich in den zugelassenen
Konfigurationen -- ``aligned model'', ``staggering zipper''usw.

Um an $K$ heranzukommen muss man den Anteil an gebildeten Helices
kennen.  Den erh\"alt man indem die Absorption (oder irgendeine
Eigenschaft) $A$ misst, die sich am einfachsten linear zur relativen
Zahl, $X_b$, an gepaarten Basen verh\"alt. Dann haben wir:
\[
X_b=\frac{A-A_s}{A_d-A_s},
\]
wobei $A_d$ und $A_s$ die Absorptionen der Doppelhelix und des
Einzelstranges sind.

Wenn das Zwei-Zust\"ande-Modell gilt, dann ist in der Gleichung \ref{K}
$X=X_b$.  (Wenn es nicht gilt, ist die Lage komplizierter, aber nicht
hoffnungslos.  Wir ersparen uns das.) Man misst nun $X_b$ in
Abh\"angigkeit der Temperatur $T$.  Bei der Schmelztemperatur $T_m$
ist im Zwei-Zust\"ande-Modell $X=X_b=1/2$. Eingesetzt liefert das
\[
K(T_m) = \frac{1}{C}\qquad \text{(selbst-komplement\"are Oligos)}
\]

Man beachte, dass wenn wir nicht ein selbst-komplement\"ares
Oligonukleotid nehmen, sondern zwei zueinander komplement\"are Spezies
$I$ und $J$ in {\em gleicher Konzentration\/} $[I]=[J]$, dann wird \ref{K} zu:
\[
K = \frac{[IJ]}{[I][J]} = \frac{2X}{(1-X)^2\cdot C},
\]
($X$ ist nun $[IJ]/([I]+[IJ])$ und $C=2([IJ]+[I])$.)
Bei Schmelztemperatur ergibt das
\[
K(T_m) = \frac{4}{C}\qquad \text{(komplement\"are Oligos)}.
\]
Eine \"ahnliche Bemerkung gilt f\"ur die Bildung einer
Haarnadel-Helix, d.h. einer intramolekularen Helixbildung plus eine
Schleife. (Wie lautet hier die Konzentrationsabh\"angigkeit der
Gleichgewichtskonstanten?)

Wir erhalten zusammenfassend (f\"ur komplement\"are Oligos):
\[
-\ln K(T_m) = \ln \frac{C}{4} = \frac{\Delta G}{RT_m} = \frac{\Delta
H}{RT}-\frac{\Delta S}{R}
\]
d.h.
\begin{equation}\label{melt}
\frac{1}{T_m}= \frac{R}{\Delta H}\ln \frac{C}{4} + \frac{\Delta S}{\Delta H}
\end{equation}

Das ist eine lineare Abh\"angigkeit der inversen Schmelztemperatur vom
log der Oligonukleotidkonzentration und ist in der Praxis
tats\"achlich recht gut erf\"ullt. Daraus lassen sich die
thermodynamischen Gr\"ossen f\"ur die Strukturbildung ermitteln.  Um
an die n\"achste-Nachbarn-Beitr\"age heranzukommen, braucht man nur
noch Differenzmessungen anzustellen. Dabei vergleicht man die
Messkurven \ref{melt} f\"ur zwei Situationen in denen sich die
komplement\"aren Oligos nur in der gew\"unschten Wechselwirkung
unterscheiden. Der Abstand der beiden Kurven bei konstanter
Schmelztemperatur ergibt das $\Delta G$, das auf den Unterschied in
den Oligos zur\"uckzuf\"uhren ist. Bei gleichem Nukleationsschritt
h\"angt dieses $\Delta\Delta G$ (die Differenz zweier freier
Bildungsenergien) von den $s$ zwischen n\"achsten Nachbarn ab (siehe
\ref{K}). Z.B. Eine Messung der Differenz zwischen AAGCUU (plus
Komplement) und AACGUU (plus Komplement) liefert
\[
\Delta\Delta G= -RT\ln (s_{AG}s_{GC}s_{CU}/s_{AC}s_{CG}s_{GU})
\]
Eine Reihe von Messungen mit geeigneten OLigos erlaubt die einzelnen
$s_i$ n\"achster Nachbarn aufzul\"osen und aus diesen die
entsprechenden elementaren freien Bildungsenergien zu ermitteln.
Diese Daten gehen in die energetische Sekund\"arstruktur-Optimierung
ein.

\end{document}

catalytic - Joyce

(Uriel Littauer, ``Reflections on RNA'', {\em Gene\/}, {\bf
135}, 209-214 (1993))



Chemische Unterschiede RNA/DNA

Hydrolyse: weil die $2'$-OH Gruppe {\em cis\/} zur
$3'$-Phosphodiesterbindung steht wird RNA, im Gegensatz zu DNA, in
alkalischem pH hydrolisiert.


GC 25 10^4 versus 4 10^4

